流产模型孕鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法的初步建立

殷治华 赵富玺 穆雅琴 刘润花 王健 冯婷婷 齐彦

妊娠是极其复杂的生理过程，近代生殖免疫学研究认为，正常妊娠的维持有赖于母胎免疫耐受的形成［1］，一旦母胎免疫失衡，可能发生原因不明复发性流产(URSA)的病理妊娠。而调节性T细胞(Treg细胞)对于母体免疫耐受胎儿必不可少，是调控母胎免疫耐受形成的重要因素［2］。

在不明原因复发性流产的研究中，探讨Treg细胞中转录因子FoxP3对细胞因子受体表达调控的分子机制，我们是以孕鼠(流产模型和正常对照)脾脏淋巴细胞为研究对象的，我们可以通过CD荧光抗体标记后，再以免疫磁珠细胞分选法(MACS)或流式细胞分选法(FACS)获得Treg细胞。因此，建立有效的流产模型孕鼠脾脏淋巴细胞分离技术是进行这些研究的先决条件。本文采用免疫磁珠细胞分选法对流产模型孕鼠脾脏Treg细胞进行分离，并对流产模型孕鼠脾脏Treg细胞的纯度和活性及获得率进行分析。

1 材料和方法

1.1 研究对象 经与雄性DBA/2J孕鼠(购自北京华阜康公司)交配受孕的雌性CBA/J孕鼠(购自上海斯莱克公司)，饲养于山西大同大学免疫研究所动物室。

1.2 主要试剂 小鼠淋巴细胞分离液;红细胞裂解液;小鼠CD4+CD25+调节性T细胞磁珠分选试剂盒;大鼠抗小鼠CD4-FITC标记、大鼠抗小鼠CD25-PE标记的单克隆抗体，MS磁珠分选柱、LD磁珠分选柱。

1.3 主要仪器 流式细胞仪:美国BD FACS Calibur;超静工作台:新加坡ESCO;倒置显微镜:日本OLYMPUS CKX-31;二氧化碳恒温培养箱:国产上海博讯HH.CP-01A;低温冷冻台式离心机:国产湖南赛特湘仪TGL-20 m;免疫磁珠磁力架、MidiMACS分选器和MiniMACS分选器:德国MACS Miltnyi Biotec。

1.4 实验方法

1.4.1 孕鼠脾脏研磨与脾细胞悬液制备 孕鼠怀孕第9天颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3 min，将孕鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上，放于无菌超净台中;在孕鼠左腹侧中部剪开孕口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏;在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪无菌分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5 ml Hank's液的培养皿中;制备脾细胞悬液:筛网研磨法:将脾脏放置筛网上，用2 ml注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液;收集制备好的脾细胞悬液，1800rpm 4℃离心8 min;弃上清，重悬细胞，加5 ml ELS(红细胞裂解液)，混匀，室温静置5 min;加Hank's液至10 ml，混匀，1800 rpm 4℃离心8 min;弃上清，加Hank's液至10 ml，混匀，筛网过滤，1800 rpm 4℃离心8 min，弃上清;5 ml RPMI 1640 重悬细胞;计数:190 μl台盼兰 +10 μl细胞悬液，混匀，取10 μl滴于计数板上，计数2个相对大方格内的细胞总数，并调整细胞浓度到108mol/L。

1.4.2 免疫荧光抗体标记及磁珠分选 磁珠阳性分选CD+4T 细胞:1 ×108个细胞用100 μl的1640 重悬，加入10 μl CD4-FITC，混匀，4℃ ～8℃孵育 15 min，再加入 1 ml RPMI，混匀，1000 r/min离心10 min，弃上清，重悬于80 μl的1640中。细胞悬液中加入40 μl CD4磁珠，混匀4℃ ～8℃孵育20 min，buffer洗涤后1000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀，用500 μl buffer重悬。将LD磁珠分选柱置于分选器中，2 ml buffer过柱，然后将细胞悬液加入其中，收集从分选柱中流出的细胞，得到CD4+细胞。

磁珠阳性分选CD+CD+T细胞和阴性分选CD+CD-425425T细胞:计数从分选柱中流出的CD4+T细胞，调细胞浓度，得量为 1 ×107个细胞。用 90 μl buffer重悬，加入 10 μL CD25磁珠，混匀，4～8℃孵育15 min，将MS磁珠分选柱置于分选器中，500 μl buffer过柱，然后将细胞悬液加入其中，用3 500 μl buffer洗柱，收集流下来的细胞悬液和洗柱液，此收集液即为CD4+CD25-T细胞，留作转化实验用。然后将柱子放入收集管中，移开磁场，向柱子中再加入1 ml buffer，用塞子快速将磁珠标记的CD4+CD25+调节性T细胞冲出柱子。

细胞计数:190 μl台盼兰 +10 μl细胞悬液，混匀，取10 μl滴于计数板上，计数2个相对大方格内的细胞总数。观察细胞存活率。细胞存活率计算公式如下:细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数100%。

1.4.3 流式细胞仪检测 取1 105个细胞用抗CD4-FITC、抗CD25-PE的抗体双色标记，室温避光孵育30 min后，用PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-细胞T的纯度。

2 结果

流产模型孕鼠脾脏细胞经过多次免疫磁珠细胞分选法两步分选得到CD4+/CD25

+调节性T细胞纯度为(93.51.1)%，T细胞纯度为(96.60.6)%，如图1、图2。

图1 分选后的调节性T细胞，CD4+/CD25+

图2 分选后的CD4+/CD25-细胞

3 讨论

CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)是一类具有调节功能的T细胞群体，其可能通过抑制CD4+/CD8+T细胞，B细胞增生，抑制抗原提呈细胞(APC)，如子宫树突状细胞(uDCs)和单核细胞成熟，抑制子宫NK细胞的细胞毒作用，以及Ig、细胞因子的产生等来维持母体对孕体的免疫耐受［3］，Zenclussen 等［4，5］发现自然流产模型小鼠中 Treg 细胞在数量和功能上比正常妊娠模型小鼠都显示有一定程度的下降，妊娠诱导的Treg细胞在母胎耐受中起到了至关重要的作用，由于该类细胞调节免疫的机理尚未得到完全阐明，因此分离、培养和扩增Treg细胞，已成为目前研究母胎免疫耐受的重要内容之一。

实验中如何获得大量Treg细胞是进行研究的前提条件。我们采用密度梯度离心法，从孕鼠脾脏组织中分离外周血单个核细胞，包括淋巴细胞、少量的单核细胞、中性粒细胞及混杂的红细胞和血小板。其原理是利用各种细胞大小、密度、表面电荷、黏附能力等的差异进行分离［6］，本实验采用小鼠淋巴细胞分离液作为分离纯化试剂。

对于用于体外扩增的Treg细胞，目前常用的分选方法是免疫磁珠分选和流式细胞分选。免疫磁珠分选一般用CD4、CD25抗原作为分选标记来纯化小鼠的Treg细胞，其原理是将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成:细胞-抗体-磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。

免疫磁珠分选和常用的流式细胞分选相比，具有快速、高效、对靶细胞的活性和功能干扰少的优点，流式细胞分选虽然可以同时对2个甚至更多的CD荧光抗体标记信号一次性进行分选，分离纯度高，但分离速度慢，细胞最终获得率低，对细胞损伤较大，对于功能性的表面分子有激惹作用。综合看来，我们采用免疫磁珠两步分选来得到调节性T细胞和T细胞，对于孕鼠脾脏淋巴细胞的分离纯化，取得较好的分离效果，细胞纯度和活性均较高，为通过流产模型孕鼠(和正常对照)来进行复发性自然流产的相关性研究提供了方法学基础。

［1］Tafuri A，Alferink J，Moller P，et al.T cell awareness of paternal alloantigena during pregnancy.Science，1995，270(5236):630-633.

［2］邱丽华，林其德.调节性T淋巴细胞与原因不明复发性流产的相关性研究.中华妇产科杂志，2004，39(12):816-818.

［3］Zhao FX，Zhang YY，Liu RH，et al.Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF-＆1，MMP-9，TIMP-3 and PAI-1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortion-prone model.J Microbiol Immunol，2006，4(2):137-145.

［4］Zenclussen A C，Gerlof K，Zenclussen M C，et al.Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion:Adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+T regulatory cells prevents fet al rejection in a murine abortion model.Am J Pathol，2005，166(3):811-822.

［5］Zenclussen A C.T regulatory cells in murine pregnancy.J Repord Immunol，2005，65(2):101-110.

［6］张诚，陈幸华，张曦，等.不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响.中国实验血液学杂志，2008，16(6):1437-1441.