五子衍宗方对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆及抗氧化损伤的影响＊

王光勇，狄国杰，曾 晓，刘苗苗，何毓敏，袁 丁，张长城，王 婷△

(1.宜昌市夷陵区人民医院，湖北 宜昌 443100;2.三峡大学医学院，湖北 宜昌 443000)

随着世界人口老龄化程度日益加重，衰老也成为人们备受关注的科学前沿。研究表明，氧化应激学说是衰老的中心学说，该学说认为，正常情况下线粒体有氧呼吸不停地产生自由基副产品(如 O2－、H2O2、OH·等)，但同时机体又具有有效的自由基清除系统(如谷胱甘肽还原系统、超氧化物歧化酶等)，两者处于动态平衡。随着年龄的增长，这种平衡逐渐被破坏，造成活性氧(ROS)开始堆积，过量的自由基可通过氧化作用攻击细胞膜及核酸、蛋白质和酶类等生物大分子，引起细胞膜上的不饱和脂肪酸产生脂质过氧化反应，核酸及蛋白质分子交联，DNA突变或复制异常及生物酶活力下降，最终导致细胞功能严重受损而致衰老［1］。

五子衍宗方是中医补肾益精的传统名方，由枸杞子、菟丝子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、车前子(盐炒)组成，具有补肾益精之功效［2］。而中医的肾虚衰老理论认为，肾主藏精、生髓通于脑，与人体生长发育衰老密切相关，补肾是延缓衰老、防治多种老年病的重要法则。现代药理研究表明，五子衍宗方具有调节体内性激素水平、改善生殖功能、增强免疫及抗氧自由基损伤等药理作用［3～5］。因此，本实验通过皮下连续注射D-半乳糖(D-Gal)建立小鼠衰老模型，研究五子衍宗方对衰老小鼠的学习记忆及抗氧化损伤的影响。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性昆明种小鼠，体重28g～32g，造模前适应性饲养1周，由湖北省实验动物中心提供(动物生产许可证号SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 药品与试剂

五子衍宗方组成:枸杞子 400g，菟丝子(炒)400g，覆盆子 200g，五味子(蒸)50g，车前子(盐炒)100g，购于宜昌市本草堂大药房。D-半乳糖购于美国Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器与设备

DT-200跳台自动测试仪，成都泰盟科技有限公司;MT-200 Morris水迷宫，成都泰盟科技有限公司;JA2003型电子分析天平，上海天平仪器厂;LDZ5-2型自动平衡离心机，北京医用离心机厂;WFZ UV-2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;PK-600S型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

2 方法

2.1 分组及给药

取雄性昆明种小鼠40只，随机分为对照组、模型组、五子衍宗方低剂量组、五子衍宗方高剂量组4组，每组10只。正常组颈背部皮下注射生理盐水，其他各组均皮下注射D-半乳糖(150mg/kg/d)进行造模，每天1次。五子衍宗方低、高剂量组分别灌服相应剂量的水提取物 0.49g/kg/d、0.98g/kg/d(分别相当于生药1.23g/kg/d、2.46g/kg/d)，正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，连续给药8周。

2.2 Morris水迷宫实验

造模后第7周开始测试。迷宫水池高50cm，直径80cm，水池等分成东、西、南、北4个象限，在其中一象限处放一平台，平台低于水面1.5cm。每次将小鼠从同一点面向池壁放入水中，先进行定位航行实验即空间学习训练，记录每只动物入水后找到平台所需时间，即潜伏期，作为学习记忆成绩。动物爬上平台后在上面逗留时间大于2s，就认为找到平台;若120s内未能找到平台，成绩按120s计，操作者引导动物至平台并使其在上面逗留2s，定位航行实验历时5d。第6天撤除平台，选择离原平台最远的象限为动物入水点进行空间探索实验。记录120s内动物在原平台所在象限的时间和经过原平台相应位置的次数，将其作为评价动物学习记忆能力的指标。整个实验在安静的房间内进行，水温控制在22℃ ±0.5℃。

2.3 跳台实验

将受试小鼠放入跳台仪中，适应环境3 min，然后通以36 V交流电。观察小鼠第1次跳下跳台的时间，即潜伏期以及5 min内小鼠由高台跳下受到电击的次数，即错误次数作为学习成绩。24 h后重复以上实验，记录潜伏期和5 min内错误次数，作为记忆成绩。测试时若小鼠停留在平台上超过5 min，其潜伏期以300 s计。

2.4 小鼠脏器指数的测定

处死小鼠后，迅速取出脑、胸腺和脾脏，经生理盐水洗净后，用滤纸沾去脏器表面水分称重，以脏器重量(mg)/体重(g)计算脏器指数。

2.5 小鼠血清中抗氧化酶的测定

小鼠眼球取血分离血清后，分别采用羟胺法和硫代巴比妥酸法检测血清中SOD活力和MDA含量。测定方法严格按照试剂盒说明书操作。

2.6 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据资料用均数±标准差(±s)表示，采用t检验观察各组间差异。

3 结果

3.1 Morris水迷宫

表1显示，在空间学习训练阶段，随着训练时间的延长，各组小鼠寻找平台的潜伏期逐渐缩短，说明小鼠获得了一定的空间记忆能力，且模型组小鼠各天的潜伏期均比对照组延长(P＜0.05或P＜0.01);五子衍宗方高剂量组在第5天的潜伏期比模型组缩短(P＜0.05)。图1显示，在空间探索实验中，模型组小鼠在平台所在象限(第三象限)的时间比对照组短(P＜0.05)，各给药组有延长的趋势;与模型组相比，穿越平台的次数各给药组显著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，说明五子衍宗方能改善衰老小鼠的学习记忆能力。

表1 Morris水迷宫中各组小鼠每天潜伏期(±s，，n=10)

表1 Morris水迷宫中各组小鼠每天潜伏期(±s，，n=10)

注:与对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05

组别潜伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天77±17 68±16 66±16 60±17 65±18模 型 组 108±10##101±11#98±14##89±18# 90±10##五子衍宗方低剂量组 101±33 95±29 86±24 79±19 78±15五子衍宗方高剂量组 94±22 87±17 81±21 77±21 72±16对照组*

图1 空间探索实验中各组小鼠停留在各象限的时间和通过平台次数

3.2 跳台实验

表2显示，模型组与对照组相比出现明显的学习记忆障碍，跳台过程中错误次数增加，潜伏期缩短。与模型组相比，五子衍宗方对D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆障碍有改善作用，可减少错误次数，延长潜伏期。

3.3 五子衍宗方对D-半乳糖所致衰老小鼠的脑指数、脾脏指数及胸腺指数的影响

表3显示，与对照组相比，模型组小鼠的脑指数和胸腺指数明显下降(P＜0.05或 P＜0.01)，与模型组相比，五子衍宗方能增加脑指数和胸腺指数。结果表明五子衍宗方能拮抗D-半乳糖导致的小鼠脏器功能的衰退，提高机体免疫力。

表2 跳台实验中各组小鼠的学习记忆成绩(±s，n=10)

表2 跳台实验中各组小鼠的学习记忆成绩(±s，n=10)

注:与对照组比较:#P＜0.05，##P ＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别错误次数对照组学习过程 记忆潜伏期(s)错误次数 潜伏期(s)37.9±13.9 2.6±1.1 214.2±67.5 0.9±0.6模 型 组 28.5±12.5 4.5±1.2## 127.6±36.1## 2.2±0.8##五子衍宗方低剂量组 34.1±9.0 3.6±1.2 147.6±44.6 1.9±0.6五子衍宗方高剂量组 36.3±12.3 3.0±1.2＊＊ 177.2±57.9＊＊ 1.4±0.5*

表3 各组小鼠脑指数、脾指数、胸腺指数的比较(±s，n=10)

表3 各组小鼠脑指数、脾指数、胸腺指数的比较(±s，n=10)

注:与对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P ＜ 0.01

组别 脑指数(mg·g－1)脾脏指数(mg·g－1)胸腺指数(mg·g－1)11.9±0.5 3.8±0.9 2.2±0.5模 型 组 9.1±0.4## 4.3±0.6 1.8±0.3#五子衍宗方低剂量组 11.1±1.1＊＊ 4.4±0.5 2.1±0.3＊＊五子衍宗方高剂量组 11.5±0.4＊＊ 4.5±0.8 2.2±0.3对照组＊＊

3.4 五子衍宗方对D-半乳糖致衰老小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影响

如表4所示，与正常组相比，模型组小鼠血清中SOD活力明显下降(P＜0.01)，MDA含量明显增多(P＜0.01)，五子衍宗方各给药组能提高衰老小鼠血清中SOD活力 (P＜0.05)，明显降低衰老小鼠血清中MDA的含量(P＜0.01)。

表4 各组小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比较(±s，n=10)

表4 各组小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比较(±s，n=10)

注:与对照组比较:##P ＜0.01;与模型组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 SOD活力(U/ml)MDA(nmol/ml)101.0±19.5 8.0±1.0模 型 组 68.1±15.1## 10.6±1.1##五子衍宗方低剂量组 72.3±11.9* 7.9±0.7＊＊五子衍宗方高剂量组 83.9±13.2* 7.8±1.1对照组＊＊

4 讨论

D-半乳糖衰老动物模型造模方法简便易行、价格低廉、结果稳定，已成为国内公认的衰老动物模型，在抗衰老药物研究等领域得到广泛应用。当机体细胞内D-gal浓度升高时，会在醛糖还原酶催化作用下还原为半乳糖醇，半乳糖醇不能被细胞进一步代谢，从而在细胞内堆积，影响细胞正常渗透压，导致细胞肿胀、功能发生障碍和代谢紊乱造成机体衰老［6］。本研究结果表明，小鼠经D-半乳糖连续注射8周后，表现为学习记忆能力下降，抗氧化水平失衡以及脑和胸腺萎缩等病理生理改变。

中医理论认为，肾主智，肾虚则智不足，认知障碍与肾虚髓空密切相关［7］。五子衍宗方是中医补肾益精的传统名方，临床多用于治疗男性不育症。本实验结果显示，五子衍宗方能改善衰老小鼠的学习记忆能力，表现为空间探索能力及记忆能力的增强。

脾脏是外周免疫器官，随年龄的增长会逐渐萎缩，导致免疫功能减退;胸腺是免疫系统的中枢器官，对维持细胞免疫和调节免疫反应发挥着重要作用。有研究表明，五子衍宗方对免疫低下小鼠的免疫功能有调节作用，对免疫受抑小鼠的特异性及非特异性免疫功能均有明显促进作用［8，9］。本实验也表明，五子衍宗方可明显提高衰老小鼠胸腺指数，说明五子衍宗方具有一定增强衰老模型小鼠免疫功能从而延缓衰老的作用。

研究表明，随着年龄的增长，机体的抗氧化防御能力逐渐降低，大量的自由基攻击细胞膜及核酸、蛋白质和酶类等生物大分子，最终导致细胞功能严重受损而致衰老。SOD是体内清除自由基的关键酶之一，主要存在于胞浆和线粒体中，SOD歧化超氧阴离子为H2O2，在过氧化氢酶的作用下转化为H2O和氧分子，从而减弱超氧阴离子的氧化损伤。MDA是自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物之一，其含量水平可间接反映了机体内细胞脂质过氧化的程度［10，11］。本实验中，D-半乳糖致衰老模型小鼠体内的SOD活性显著降低，MDA含量升高，五子衍宗方能增强小鼠血清中SOD活性，减少MDA的产生，从而改善D-半乳糖所致的氧化损伤发挥抗衰老作用。

综上所述，五子衍宗方能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力，同时增强机体的免疫功能，提高机体的抗氧化防御系统发挥抗衰老作用。

［1］Dr9ge W.Oxidative stress and aging［J］.Adv Exp Med Biol，2003，543(2):191-200.

［2］葛争艳，金龙，刘建勋.五子衍宗丸补肾壮阳作用的实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(7):173-176.

［3］王学美.五子衍宗丸对雄性大鼠下丘脑单胺类递质性激素和生育能力的影响［J］.中国中西医结合杂志，1993，13(6):349-351.

［4］杨阿民，刘保兴，张圣强，等.五子衍宗丸改善肾精亏虚大鼠支持细胞功能的机理研究［J］.北京中医药大学学报，2010，33(6):173-176.

［5］张长城，贾亮亮，许佳，等.五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍保护作用的研究［J］.中国中医基础医学杂志，2010，16(7):570-571.

［6］蒋万志，张洪泉.枸杞多肽对 D-半乳糖诱导小鼠的抗衰老作用及其可能机制［J］.国际药学研究志，2010，37(1):47-50.

［7］余月明，马援.自由基衰老学说、肾虚与衰老及补肾抗衰老研究［J］.陕西中医，1993，14(4):187-188.

［8］王洪武，贾亮亮，徐媛青，等.五子衍宗汤对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(4):144-146.

［9］金龙，葛争艳，刘建勋.五子衍宗丸对小鼠记忆力、免疫功能、耐缺氧及耐疲劳的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(16):123.

［10］Sadi G，Güray T.Gene expressions of Mn-SOD and GPx-1 in streptozotocin-induced diabetes: effectofantioxidants［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2009，327(1-2):127-34.

［11］Li YG，Ji DF，Zhong S.Saponins from Panax japonicus protect against alcohol-induced hepatic injury in mice by up-regulating the expression of GPX3，SOD1 and SOD3［J］.Alcohol Alcohol，2010，45(4):320-331.