肾消康对糖尿病大鼠肾组织基因Gna12表达的影响*

乔 羽，解 颖，白玉宾，王 兵，陈 飞，刘春红，柳成刚，常佳怡，高恩宇，韩洁茹，姜德友

（黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的一种严重的微血管并发症，其主要病理改变为肾小球肥大，基底膜增厚，以及系膜区基质增加，导致弥漫性或结节性肾小球硬化。临床上早期表现为尿中排出微量白蛋白，继之出现临床蛋白尿，最后进展为慢性肾功能不全。近年来随着其发病率和病死率的提高，DN严重地威胁着人类的健康，影响患者的生存质量，因此，对DN的研究已成为世界性医学攻关课题。由于该病的发病机制较复杂，临床尚无理想药物，而中医药在防治DN方面颇具优势，为此笔者借助分子生物学研究方法，采用基因芯片技术，利用目前国际学术界公认的美国Affymetrix公司生产的Rat2302.0基因表达谱芯片，首先进行差异基因筛选，然后进一步用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测，寻找DN相关基因，探讨DN病变机制，筛选药效靶点，阐释中药复方肾消康治疗DN的作用机制，为此笔者对链脲佐菌素（STZ）诱导DN大鼠的肾脏基因表达谱进行了研究。本文仅报告肾消康对DN大鼠肾脏组织基因鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α12（Gna12）表达的影响。

1 基因芯片实验

1.1 主要试剂、药品和仪器 链脲佐菌素（STZ）为Calbiochem公司产品；肾消康制成浸膏，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备，-20℃的冰箱保存，使用前加温至37℃。有关芯片检测试剂及仪器，均为上海生物芯片有限公司制备，包括Affymetrix Genechip Scanner2.0、Affymetrix Fluidics Station450、Affymetrix Genechip Hybridization Oven640等。

1.2 动物造模及分组 Wistar大鼠120只，雄性，体质量180～210 g（由哈尔滨医科大学实验中心提供），合格证号：P00102004，分笼饲养，每笼饲养7只，室温（18±2）℃，相对湿度 50%～60%，通风良好，每日光照12 h，自由摄食、饮水。适应性喂养1周后，随机选取10只作为空白对照组，以普通饲料喂养，经左下腹注射柠檬酸缓冲液25 mg/kg（pH 4.4），其余大鼠称质量，以25 mg/kg STZ左下腹腔注射，每日上午注射1次，连续5 d。注射前12 h禁食，不禁水。注射后1 h，大鼠自由饮水、进食。造模1周后测血糖。血糖值在16.7 mmol以上的大鼠共50只，再随机分为模型组、西药对照组、肾消康高、中、低治疗组，各组均10只。各组均喂以高热量饲料（1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、1%蔗糖、78%为基础饲料）19周，继续喂养普通饲料7周，共喂养26周。

1.3 给药方法 喂养高热量饲料19周后，随机抽取各组大鼠进行病理检测，光镜、电镜下病理检测近似人类糖尿病慢性肾组织损伤的病理变化。空腹称质量，按大鼠的体表面积与成人剂量之间的换算关系计算给药量。肾消康治疗组给药量为0.79 g/mL，每200 g体质量每次给药2 mL，每日灌胃1次，空白组、模型组以等量生理盐水灌胃。

1.4 标本采集 以电子秤称取每只大鼠体质量，禁食、水12 h，摘眼球取血，分装不同试管，4℃保存备检，以测肌酐、尿素氮等指标。乙醚麻醉后，常规固定、消毒、铺布等处理，沿正中线切开腹壁，快速用180℃、12 h处理过的手术剪刀摘取肾脏、称质量，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作。将右肾置于4%多聚甲醛固定，供光镜观察及免疫组化实验使用；将1/3左肾置于2.5%戊二醛中固定，以备制做电镜；将其余2/3左肾置于液氮中冻存以备提取核糖核酸（RNA）使用。

1.5 统计方法 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.6 DN大鼠肾脏损伤的生化指标及病理变化

1.6.1 血肌酐、血尿素氮的变化 模型组血尿素氮（BUN）水平明显升高，与空白组比较差异具有统计学意义（P<0.01），各治疗组较模型组有较大幅度降低（P<0.01），其中西药对照组、肾消康高剂量组和中剂量组（P<0.01），肾消康低剂量组（P<0.05），各治疗组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；血肌酐（SCr）模型组水平明显升高，与空白组比较差异具有统计学意义（P<0.01），各治疗组较模型组有较大幅度降低（P<0.01），各治疗组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。说明肾消康可使血肌酐、血尿素氮的生化指标降低。

表1 各组血清 Scr、BUN 水平比较（n=10，±s）Tab.1 Comparison of serum levels of Scr and BUN in three groups（n=10，±s）

表1 各组血清 Scr、BUN 水平比较（n=10，±s）Tab.1 Comparison of serum levels of Scr and BUN in three groups（n=10，±s）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别Scr（μmol/L）BUN(mmol/L)空白组 107.19±13.216.33±1.14模型组 162.66±17.06** 15.78±3.95**西药对照组 133.74±16.7## 11.34±2.26##高剂量组 128.80±18.66## 10.95±0.97##中剂量组 121.44±22.48## 10.52±2.17##低剂量组 123.9±21.37## 11.78±3.35#

1.6.2 尿微量白蛋白、β2-微球蛋白的变化 模型组大鼠尿微量白蛋白（Alb）、β2-微球蛋白（β2-MG）排泄量明显高于空白组（P<0.01），治疗组与模型组比较，尿微量白蛋白、β2-微球蛋白排泄量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。提示肾小球和肾小管的结构和功能受损，肾消康能降低尿微量白蛋白、β2-微球蛋白排出量，说明其对肾脏结构及功能有较好的保护作用。

表2 各组 24 h Alb，β2-MG 水平比较（n=10，±s）Tab.2 Comparison of Alb and β2-MG levels during 24 h in three groups（n=10，±s）

表2 各组 24 h Alb，β2-MG 水平比较（n=10，±s）Tab.2 Comparison of Alb and β2-MG levels during 24 h in three groups（n=10，±s）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 Alb（mg/24 h）β2-MG（mg/24 h）空白组 25.68±4.321.47±0.25模型组 70.96±9.52** 3.95±0.78**西药对照组 40.25±9.83## 2.62±0.79##高剂量组 36.04±8.80## 2.55±0.70##中剂量组 32.56±8.01## 2.45±0.86##低剂量组 33.52±7.86## 2.51±0.52##

1.6.3 肾脏组织病理及超微结构变化 光镜下观察，空白组：大鼠肾小球毛细血管基底膜厚薄均匀。近曲小管的上皮细胞较少，胞浆，管腔狭窄而不规则；远曲小管上皮细胞较多，胞浆伊红淡染，管腔宽而规则，见图1。模型组：肾小球系膜细胞增生，基质堆积明显，肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，发生透明样改变，肾小球与囊壁粘连（渗出性肾小球硬化），小球分叶、分瓣明显（弥漫性肾小球硬化），趋向纤维化，见图2、图3。肾消康中剂量组：少数肾小球轻微的基底膜增厚，轻微的透明样变，部分肾小球囊壁增厚，少数肾小球粘连、有分叶状，有少数纤维增生，少数有局部系膜基质增生及轻度的肾小管扩张和上皮细胞脱落，见图4。

电镜下观察，空白组：近端小管上皮细胞微绒毛密集，胞质内可见大量圆杆状线粒体和少量溶酶体，游离蛋白丰富，高尔基复合体、粗面内质网发达。远端小管上皮细胞结构正常，细胞器形态清晰，系膜细胞完好，见图5。模型组：肾小球基膜增厚，足细胞坏死，滤孔膜溶解，血管内皮细胞质呈网状排列。近端肾小管上皮微绒毛溶解脱落，细胞间连接消失。胞质内溶酶体数量增多，线粒体絮状变。远端小管坏死的细胞质膜脱落，质膜内褶区可见较多的小空泡，见图6、图7。肾消康中剂量组：肾小球毛细血管内皮清晰可见，滤孔膜栅栏状排列，足细胞核清晰，部分核呈凋亡状。近端小管微绒毛脱失、溶解，胞质内有大量的溶酶体，游离核蛋白体丰富。间质血管内皮功能活跃，细胞器数量增多，见图8。

图6 模型组肾脏（电镜 ×6000）Fig.6 Kidneyofmodelgroup(electron microscope×6000)

图5 空白组肾脏（电镜 ×6000）Fig.5 Kidney of blank group(electron microscope×6000)

图7 模型组肾脏（电镜 ×6000）Fig.7 Kidney of model group(electron microscope×6000)

图8 肾消康中剂量组肾脏（电镜 ×6000）Fig.8 Kidney of Shenxiaokang middle dose group(electron microscope×6000)

1.7 基因芯片实验方法 从各组大鼠中取肾脏，使用QIAGEN RNA Isolation Kit抽提总RNA，由纯化的总RNA合成双链cDNA，经PLG提取、乙醇沉淀将双链互补脱氧核糖核酸（cDNA）纯化，用Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素标记互补核糖核酸（cRNA）合成，QIAGEN Rneasy Columns法体外转录纯化生物素标记的cRNA，用分光光度计分析RNA浓度进行质控，凝胶电泳检测产物，片断化cRNA，合成cRNA探针。合成好的cRNA探针经片段化处理后用于与基因芯片杂交。芯片的杂交、洗脱、染色及检测利用Affymetrix公司生产的专用设备“基因芯片检测工作站”进行，一切操作过程均按Affymetrix公司推荐的条件进行。

1.8 基因芯片检测数据的处理 芯片扫描所得数据应用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”进行数据处理。

1.9 基因芯片筛选结果按照比较严格的条件筛选出差异表达基因，表达差异2倍以上的基因列表，包括基因名称、GenBank号、Uni号和染色体定位。其中，NM_03 段落tr.1：Gna12即是筛选出的差异表达基因之一，在DN大鼠肾脏组织表达下调，经肾消康治疗后表达上调，见图9。

灰度扫描图中采用芯片图像分析软件分析芯片灰度扫描图，得到芯片上每个基因点的原始信号值（包括前景信号值和背景信号值），从而进行差异表达基因的判定。散点图中X轴为对照组信号值，Y轴为实验组信号值，图中红色点为实验组和对照组该基因的Detection均为P，蓝色为两组中有一个值不是P，而黄色为两组均为A。这些点在Affymetrix公司的MASS5.0软件中可以显示Probe Set ID。

2 实时荧光定量RT-PCR的实验检测

2.1 主要实验仪器 PCR仪，PTC-225 Peltier Thermalcycler， MJ Research Inc.，Waltham，Massachusetts；荧光定量PCR仪，Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler，Corbett Reseach，Sydney，Australia。

DN大鼠肾组织 Gna12的 sense primer、antisense primer、product值如下：sense primer：5’-GGAGAAGGTGAAGTCGGTGAGC-3’，length：22 bp，Tm值：60.30℃。anti-senseprimer：5’-GGCAGTGGTGAAGTGGTGGAAC-3’，length：22 bp，Tm 值：61.30℃。product length:154 bp,product Tm值：92.50℃。

2.2 实验方法 本实验采用Eve green法，使用TAKARA公司的RNA PCR kit反转录试剂盒,按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。反转录体系 10 μL，30℃反应 10 min，42 ℃反应 30～50 min，95℃加热5 min，4℃反应5 min中止。

利用TAKAR公司的TaKaRa Ex Taq Rt-PCR Version.2.1进行荧光定量PCR反应。反应体系25μL，反应条件95℃ 120秒，95℃ 15秒，60℃ 20秒45个循环，72℃20秒中止。

2.3 实时荧光定量RT-PCR数据分析 实验结果利用软件Rotor-Gene 6.0以及Excel 7.0进行数据分析处理。

2.4 实时荧光定量RT-PCR结果

2.4.1 Gna12的扩增曲线 见图10。

2.4.2 Gna12的标准曲线 见图11。

2.4.3 Gna12的扩溶解曲线 见图12。

2.4.4 Gna12的Copies值 Gna12实时定量结果表明，模型组大鼠肾脏组织Gna12表达下调，而经肾消康治疗后大鼠肾脏组织中Gna12表达上调，见图13。

3 讨论

细胞间通过传递信号分子相互交流，G蛋白系统是细胞中最常见的信号传递方式。G蛋白即鸟嘌呤核苷酸（GTP）结合蛋白，具有GTP酶活性，是在细胞信号通路中起信号转换器或分子开关作用的蛋白质，是细胞信号传导通路上的重要组成部分，体内外许多激素、递质、毒物和药物等均可通过G蛋白引起细胞内相应的第二信使改变，导致一系列生理生化变化[1]。

G蛋白可分为两类：1）由α、β和γ亚单位组成的异三聚体，在膜受体与效应器之间的信号转导中起中介作用；2）小分子G蛋白，为分子质量21～28 ku的小肽，只具有G蛋白α亚基的功能，在细胞内进行信号转导，属于小GTP酶的Ras超家族。

当受体被配体激活后，Gα上的GDP为GTP所取代，这是G蛋白激活的关键步骤。此时G蛋白解离成GTP-Gα和Gβγ两部分，它们可分别与效应器作用，直接改变其功能，如离子通道的开闭，或通过产生第二信使影响细胞的反应。Gα上的GTP酶水解GTP，终止G蛋白介导的信号转导。此时，Gα与Gβγ又结合成无活性的三聚体[2]。

目前，Gα亚基主要有Gαs、Gαi、Gαq/11 和Gα12/13几种不同的类型。它们主要是在效应识别上不同，但却有着相似的激活机制。Gαi抑制ATP生成cAMP；Gαq/11刺激膜结合的磷脂酶C测试，然后将PIP2裂解成两个第二信使：IP3和二酰基甘油（DAG）；Gα12/13参与Rho家族GTP酶信号转导（通过RhoGEF家族）和控制细胞骨架重构，从而调节细胞的迁移[3]。

细胞骨架是一动态纤维网络，具有细胞收缩、维持细胞形状、细胞运动、黏附、吞噬等功能[4]。细胞骨架的主要成分是微丝，肌动蛋白（actin）是微丝的基础蛋白，以纤维状肌动蛋白（F-actin）和单球状肌动蛋白（G-actin）两种形式存在并相互转换，调节系膜细胞的收缩状态，从而调节毛细血管口径及肾小球滤过率[5]。

G蛋白是细胞中重要的信号转导分子，是许多信号传递途径的中心环节，因此也就成了众多药物和毒素攻击的靶位点。事实上，如糖尿病、失明、过敏、抑郁症、心血管缺陷和某些癌症疾病以及其他病症，都被认为是由于G蛋白信号紊乱引起的[6]。但Gna12在DN发病机制中的作用目前还不得而知，国内外相关研究极少，从本实验研究结果可以看出：在DN状态下，模型组大鼠肾脏Gna12表达下调，笔者由此推断高糖影响了Gna12的信号转导功能，从而使F-actin解聚，细胞骨架重构导致系膜细胞收缩功能失调，造成早期DN肾小球的高滤过状态，导致DN的发生。

DN为本虚标实之证，病及五脏六腑、气血经络，其脏腑虚损以脾肾为著，脾虚则其运化、升清、散精的作用不足，血中精微不能输布脏腑，濡养四肢，积蓄过多则随小便漏泄体外，发为消渴[7]。脾肾两虚是病理基础，湿浊瘀血既是病理产物又是致病因素，脾肾亏虚、湿浊瘀血贯穿DN始终。

肾消康具有补肾健脾、利湿泄浊、化瘀通络的作用。肾阴得充则一身阴液得养，肾阳不虚，其蒸腾气化功能正常，肾之封藏功能如常，精微物质存内为机体所用而不外泄。健脾益气，培补后天之本，使水谷精微得以四布，脏腑得养，清者得升，浊者得降，湿浊得化，精微得布；脾气充盛又可化生气血，血流通畅，祛除瘀血形成之源。利湿泄浊可通过促进代谢，使体内精微物质得到利用，使本身有害物质得到清除。活血化瘀可使经络之瘀滞得除，各脏腑得新血濡养。

肾消康，其药物组成有生地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮、人参、黄芪、枸杞子、陈皮、葛根、水蛭等。方中以六味地黄汤为基础方，滋阴清热。枸杞子药性平和，为平补阴阳之佳品，用之增强补肾之力；人参、黄芪补虚扶正，且人参、黄芪与茯苓、泽泻、葛根、水蛭配伍，使扶正与祛邪协调兼顾，祛邪不伤正、扶正不留邪；陈皮与葛根配伍，陈皮辛散苦降，长于理气燥湿健脾泻胃浊，调中快膈；葛根升津、升发清阳、鼓舞脾胃清阳之气；水蛭破血逐瘀，效强而不伤正。方中诸药相合，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，标本兼顾，为临床治疗DN的良方[8]。王盛发等[9]通过糖尿病肾病中医治疗用药规律分析，总结了一些用药频度较高的中药，如黄芪、茯苓、山药、山茱萸等，中药类型则以补益、健脾、活血、清热类为多，这为本方用药提供了有力的参考依据。

现代药理证实：生地、山茱萸、山药、黄芪、茯苓、泽泻均有降血糖作用；黄芪有双向调节血糖作用和减少尿蛋白排泄作用；茯苓、泽泻降糖降脂改善糖脂代谢，增加肾血流量，促进肾功能恢复[10]。谭俊珍等[11]认为六味地黄丸对糖尿病大鼠糖、脂代谢有一定的改善作用。

4 结论

本研究应用Affymetrix Rat2302.0基因芯片检测糖尿病大鼠肾脏基因表达谱，筛选差异表达基因，Gna12基因是筛选出的肾脏差异表达基因和药效靶点之一，并对该基因做荧光定量RT-PCR测序分析。基因功能分析表明，在DN状态下，模型组大鼠肾脏Gna12表达下调，表明Gna12的信号转导功能受到影响。肾消康中剂量组Gna12表达上调，中药复方肾消康可调控Gna12的信号转导功能，对Gna12有良性调节作用。其作用机制有待于更深入研究。

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