清肺化痰胶囊对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道上皮水通道蛋白-5表达的实验研究

2012-11-29尹新中刘桂颖朱振刚狄冠麟

天津中医药 2012年5期

尹新中，刘桂颖，朱振刚，狄冠麟，陈磊

（1.天津中医药大学第一附属医院呼吸科，天津 300193；2.天津中医药大学附属保康医院，天津 300193）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展[1]。其患病人数多，病死率高[2]。

痰液是影响COPD病情和预后的危险因素，同时也是其病理产物，更是治疗COPD的关键。本实验通过清肺化痰胶囊对COPD大鼠气道上皮细胞水通道蛋白-5（AQP-5）表达和肺组织匀浆中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平的影响进而探讨中药治疗COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物雄性Wistar成年大鼠，鼠龄200 d，体质量（200±20）g，由天津中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 AQP-5免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、NE酶联免疫吸附实验（ELISA）A试剂盒（北京尚柏生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模大鼠实验环境驯养1周后，36只大鼠按随机数字表法分为6组（模型组、空白组、清肺化痰组、氨溴索组、痰热清组、红霉素组），每组6只。参照文献宋一平[3]、李泽庚[4]的方法制备COPD大鼠模型：6个实验的大鼠除空白组外均参照文献进行造模，即第1天和第14天气管内注入脂多糖（LPS）200 μg/200 μL，第 2～13 天、第 15～28天在72 L密闭箱内熏5%大前门牌香烟，0.5 h，每日上午。

1.2.2 药物制备及给药方法实验用药由天津中医学院第一附属医院药房统一购进。大鼠的用药剂量按体表面积[5]比值进行换算，持续给药14 d。模型组给予10 mL/kg生理盐水灌胃；空白组不给药；清肺化痰组给予清肺化痰胶囊溶液灌胃，按剂量0.56 g/（kg·d）给药（清肺化痰胶囊配制成0.14 g/mL混悬液）；氨溴索组给予盐酸氨溴索注射液腹腔注射，2.7 mg/（kg·d）；痰热清组给予痰热清注射液腹腔注射，1.8 mL/（kg·d）；红霉素组给予乳糖酸红霉素腹腔注射，0.09 g/（kg·d）。

1.2.3 标本制备实验第29天将大鼠颈椎脱臼处死。自剑突下由皮肤至皮下向上剪开胸腔，迅速暴露肺部，取左肺上叶和主支气管，生理盐水漂洗干净，吸水纸拭干，置于10%中性甲醛溶液中固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明标本，浸蜡，包埋，切片。0.2 g右肺中叶组织匀浆分别离心后留取上清液待检测。

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 AQP-5的检测参照陈国兵[6]、王可[7]、刘少滨[8]的方法，5 μm切片脱蜡至水,3%的过氧化氢（H2O2）灭活内源性过氧化物酶5～10 min，热修复抗原，10%正常血清封闭 20 min，一抗（1∶1600）为兔抗大鼠AQP-5多克隆抗体，4℃过夜，加生物素化山羊抗兔 IgG（二抗），37℃，20 min，滴加链霉素和素复合体（SABC），37℃，20 min，各步后均在磷酸盐缓冲液（PBS）中漂洗数次。二氨基联苯胺（DAB）显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，电子显微镜观察，照相。阴性对照组滴加PBS代替AQP-5一抗，处理同前。染色结果判定：肺组织出现明确的棕黄或棕褐色颗粒为阳性。每组于400倍高倍镜下随机选取30个视域，用HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行定量分析。以0.207 μm 象素点长，在 1.8256×104μm2测量窗下，测量棕黄色反应物信号的总面积（一个视域中阳性信号的总面积）、面积百分比（总面积与参考面积之比，也称面密度）、积分光密度（各个单独探测象素密度分布的总和，反应阳性信号的强度），分析各组大鼠肺细支气管上皮对AQP-5表达的相对水平。

1.2.4.2 NE的检测按照中性粒细胞弹性蛋白酶ELISA说明书，测定肺组织匀浆上清的NE。操作步骤简述如下：1）加样。2）弃去液体，甩干，不用洗涤。3）温育，弃液，甩干，洗板。4）加检测溶液B工作液，温育。5）弃液，甩干，洗板。6）加底物溶液，显色。7）加终止液。8）用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

1.3 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行。实验数据均用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理改变光镜下（×100、×400）观察：模型组大鼠支气管上皮变性、坏死，纤毛缺失；管壁增厚，部分区域黏膜层上皮细胞脱落、不完整。肺泡壁可见塌陷、肺泡腔扩大及大泡形成；间质及大气管黏膜下可见大量淋巴细胞、中性粒细胞及组织细胞浸润，小动脉壁明显增厚。空白组未见上述改变。其余各治疗组大鼠肺组织病理改变均轻于模型组，镜下可见支气管上皮轻度变性、脱落，部分纤毛缺失；管壁轻度增厚。肺泡壁未见明显塌陷，偶见肺泡腔轻度扩大，未见大泡形成；间质可见少量淋巴细胞浸润。小动脉壁轻度增厚。见图1、图2。

2.2 各组大鼠肺细支气管上皮细胞AQP-5免疫组化染色结果肺细支气管上皮细胞AQP-5蛋白面积百分比、积分光密度模型组明显低于清肺化痰组、沐舒坦组、红霉素组、痰热清组和空白组（P＜0.05）；清肺化痰组与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；清肺化痰组高于沐舒坦组、红霉素组、痰热清组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1 6组大鼠肺组织HE染色（×100）Fig.1 Lung tissue HE staining of six groups（×100）

图2 6组大鼠肺细支气管上皮细胞AQP-5免疫组化染色(×400)Fig.2 The immunohistochemical staining of AQP-5 bronchial epithelial cells(×400)

表1 各组大鼠肺细支气管上皮细胞AQP-5表达（±s）Tab.1 Expression of AQP-5 in the bronchiolar epithelial cells of lung in rat（±s）

组别 n模型组 6空白组 6清肺化痰组 6痰热清组 6红霉素组 6沐舒坦组 6面积百分比（%）积分光密度(IOD值)1.353±0.5060112.958±44.1786.480±3.0001063.440±553.9425.230±1.6960599.235±166.3783.835±2.1210375.775±200.2041.679±1.0050201.229±128.0672.574±1.0940233.918±97.064

2.3 肺组织匀浆的NE含量检测结果模型组明显高于清肺化痰组、沐舒坦组、红霉素组、痰热清组和空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而清肺化痰组与空白组、痰热清组、红霉素组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），清肺化痰胶囊组明显低于沐舒坦组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织匀浆NE水平（±s）Tab.2 The quantity of NE in the lung homogenate（±s）mg/mL

组别 n NE水平模型组 61.672±0.273空白组 60.445±0.104清肺化痰组 60.605±0.110痰热清组 60.482±0.134红霉素组 60.720±0.204沐舒坦组 61.048±0.138

3 讨论

清肺化痰胶囊是本院呼吸科的协定处方，临床用于治疗COPD急性期患者颇有成效[9-10]。其依据COPD急性期以标实为主，多见“痰、热、瘀”，以清肺化痰，活血化瘀为主要治法而拟成。方中炙麻黄、生石膏一辛温，一辛寒，一宣肺，一清肺，且能透邪于外，合用则相反之中寓相辅之意，宣肺平喘而不助热，清解肺热而不凉遏。杏仁降利肺气而平喘咳，与麻黄相配则宣降相因，与石膏相伍则清肃协同。吴继全[11]认为肺系病常影响肠胃功能，肺气不降易致胃气不降，而有胀满、大便不畅等表现，常选具有肺胃同治药物,如杏仁。黄芩、瓜蒌清肺化痰，半夏、厚朴降气化痰止咳，桃仁祛瘀通络平喘，炙甘草调和诸药。诸药相伍，共奏清肺化痰、活血祛瘀之功效。

黏液的黏稠度由黏蛋白和水分的多少决定，AQP-5是一参与水分转运的跨膜蛋白，其表达与功能异常将引起水盐代谢失衡而影响气道黏液的黏稠度[12]。AQP不仅与水转运有关，还可能参与气道黏液分泌调节以及气道反应性的调节，因而AQP可能与气道阻塞性疾病如COPD、肺囊性纤维化、哮喘等有关[13]。从目前的研究来看，已发现10余种AQP，其中AQP-5决定着气道表面液体层的含水量，进而影响气道表面液体层的理化性质，影响着黏液纤毛清除系统的功能，从而影响黏液分泌状态，因此，与呼吸道黏液高分泌相关的水通道蛋白多选用AQP-5[14]。陈智鸿等通过实验研究表明AQP-5基因缺失可能使小鼠气道过敏原的应激性提高，从而促进黏液高分泌[15]。王可等[7]的研究表明，COPD患者的黏膜下腺AQP-5较对照组表达降低，气道上皮分泌的哮喘气道黏蛋白（MUC5AC）以及黏膜下腺分泌的黏蛋白较对照组均增加，且AQP-5的表达与MUC5AC和黏蛋白的分泌具有负相关关系，提示AQP-5可能参与了COPD患者气道黏液分泌。

NE可使腺体分泌增多，纤毛上皮细胞受损，还能诱导白细胞介素-8（IL-8）的分泌，或分解激肽释放酶原使激肽释放酶具有活性，放大炎症反应。另外，NE可增强病原菌与上皮细胞间的黏附力，使感染容易发生，还可降低补体或抗体的调理作用，降低病原菌的清除率，并且是目前已知的促黏蛋白生成和分泌的最强刺激因子，并呈时间依赖性增加气道黏蛋白的表达[16]。NE能够消化、降解细胞外基质和上皮连接结构造成气道上皮完整性破坏和肺组织损伤，并通过促进炎性细胞聚集，引起黏液高分泌等机制促使慢性阻塞性肺疾病气道炎症与重构的发生[17]。

本实验结果表明，清肺化痰胶囊治疗COPD，其机制在于能调节AQP-5的表达，调节黏蛋白分泌，抗炎症反应，抑制NE的表达，调节蛋白酶-抗蛋白酶失衡，从而改善黏液高分泌状态，起到缓解COPD临床症状、促进排痰、提高生活质量的目的。本实验设计中还存在不足，比如所用大鼠数量少，两组实验数据的相关性分析未完成。最后，因中药的多靶点效应，清肺化痰胶囊调节大鼠气道上皮APQ-5表达的作用途径尚不明确，有待更进一步探索研究。

[1]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30（1）：8－17.

[2]林旋龄，钟亮环，刘小虹.治喘之法，不只在于肺肾亦在于脾[J].天津中医药大学学报,2010,29(4):177-178.

[3]宋一平.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预的影响[J].中华内科杂志，2000，39（8）：556－557.

[4]李泽庚，王传博，彭波，等.慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺证大鼠模型的建立[J].天津中医药，2010，27（1）：43－45.

[5]徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2006：195－201.

[6]陈国兵，许峰，卢仲毅，等.不同发育阶段大鼠肺水通道蛋白表达的变化[J].中国当代儿科杂志，2008，10（4）：523－526.

[7]王可，冯玉麟，文富强，等.慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮水通道5的表达与黏液高分泌[J].中国呼吸与危重监护杂志，2006，5（5）：357－360.

[8]刘少滨，欧阳金生，黄绍光，等.氨溴索对脂多糖-烟雾诱导大鼠水通道蛋白5的影响[J].上海交通大学学报（医学版），2008，28（3）：307-310.

[9]刘兰萍，尹新中，刘贵颖，等.清肺化痰胶囊治疗COPD急性发作期临床观察 [J].辽宁中医杂志，2008，35（12）：1867－1868.

[10]尹新中，刘贵颖，张慧琪，等.中西医结合治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期 30 例临床分析[J].天津中医药，2005，22（2）：117－118.

[11]吴继全，王雪京，张洪春，等.晁恩祥教授治疗肺系病的特色经验[J].天津中医药，2008，25（5）：358－359.

[12]周正，刘剑波.糖皮质激素对哮喘小鼠肺组织水通道蛋白5表达的影响[J].江苏医药，2010，36（8）：924－926.