补肾清毒法对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型和功能的影响*

彭皓均 沈 强△ 刘亚敏 徐秋英 吴 彦 王 丹

1.广州中医药大学第一附属医院四内科 (广东广州，510405) 2.暨南大学附属黄埔中医院3.安徽省太湖县人民医院

我国属乙型肝炎高流行地区。一般人群的HBsAg阳性率为9.09%［1］。目前认为，CHB患者体内DC功能受损，可能导致HBV感染慢性化［2，3］。我们依据多年治疗经验，认为从“伏邪温病”的理论解释CHB的发病和症状更为合理［4］，并发现“补肾清毒法”具有明显修复肝功能的作用［5］。因此，我们继续运用“补肾清毒法”治疗CHB并观察治疗前后外周血树突状细胞表型和功能的变化情况，探讨其改善CHB患者免疫功能的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年4月-2009年12月期间广州中医药大学第一附属医院门诊就诊的CHB患者49例，其中男37例，女12例，平均年龄25.86岁。病例均经ELISA检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc，PCR法检测 HBV DNA。其诊断符合2005年12月制订的《慢性乙型肝炎防治指南》［6］。纳入标准:HBsAg和HBeAg持续阳性半年以上;HBV DNA阳性 (斑点杂交法)，HBV DNA载量 ＞105copies/ml;血清ALT持续波动于正常上限2～5倍达6个月以上。排除标准:丙型肝炎、丁型肝炎、艾滋病、失代偿性肝病;产妇或哺乳期妇女;半年内曾使用过抗病毒药物及免疫调节剂者。

将49例患者随机分为两组，其中补肾清毒法治疗组28例，核苷类似物治疗组21例，两组患者在年龄、病程、ALT、HBV DNA方面比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。见表l。另取10例健康人作为正常对照组。

表1 两组患者临床资料比较()

表1 两组患者临床资料比较()

1.2 试剂和仪器 淋巴分离液 (Ficoll，1.077 g/mL)购自Axis-shield公司;RPMI-1640培养液、DPBS购自 GIBCO公司;胎牛血清 (FBS)购自PAA公司;牛血清白蛋白5g(BSA)购自Roche公司;重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF 1×107μ/mg)、重组人白细胞介素4(rhIL-45×106μ/mg)、重组人肿瘤坏死因子-α (rhTNF-α 2 ×107μ/mg)、重组人肿瘤坏死因子-α (rhTNF-α 2×107μ/mg)均购自Peprotech公司;异硫氰酸荧光素标记抗人CD80、CD83、HLADR单克隆抗体与藻红蛋白标记抗人CD86单克隆抗体购自Biolegend公司;异硫氰酸荧光素标记抗人HLA-A2单克隆抗体购自Cyclex公司;二甲基亚砜 (DMSO)购自Sigma公司;丝裂霉素C(MMC 2mg)购自Roche公司。Beckman Coulter流式细胞仪为ALTRA公司产品。显微照相系统IX70为日本Olympus公司产品。

1.3 方法

1.3.1 治 疗方法 补肾清毒法组:桑寄生、旱莲草、小叶凤尾草、丹参、茵陈各20g，杜仲、山栀子各15g，叶下珠30g，甘草5g。1剂/d，水煎为250ml，温服。核苷类似物组:拉米夫定 (葛兰素史克)100mg/次，口服，1次/d。两组疗程均为24周。

1.3.2 外周血单个核细胞 (PBMC)的分离 使用肝素抗凝管收集CHB患者及健康人外周血30ml，用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，加入含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，计数，按细胞数 (2～6)×106/孔接种到6孔培养板中，培养体积3ml。在37℃、5%CO2细胞培养箱中温育2小时，去除未贴壁细胞，获得贴壁的PBMC。

1.3.3 冻存自体PBLs 将上述未贴壁细胞离心，加入配好的冻存液，置于4℃冰箱1小时，-20℃冰箱2小时，-80℃冰箱过夜，第2天转液氮保存。

1.3.4 DC体外定向诱导分化和培养 按照Roman等［5］分离培养DC的方法稍作修改。贴壁单核细胞，每孔3ml加入完全培养基RPMI-1640(含10%胎牛血清)，按rhGM-CSF 100ng/ml和rhIL-4500U/ml的终浓度加入细胞因子。置37℃，5%CO2培养箱继续培养。第3天、第7天半量换液1次 (含细胞因子rhGM-CSF 100ng/ml和rhIL-4500U/ml)。第9天每孔再添加各 10μl rhTNF-α (10ng/mL)及 rhIL-1β (10ng/ml)，共培养11天，于第11天收集DC。

1.3.5 倒置显微镜观察 在每次换液时，用倒置显微镜观察培养孔中的DC细胞形态特征变化，并摄像记录。

1.3.6 流式细胞仪检测DC表面分子的表达 收集培养至11天的DC，洗涤后计数配成2×105个细胞/ml加入流式标记管，分别向对应管加入 FITC-CD80、CD83、HLA-DR、PECD86各5μl。阴性对照设一管，同型对照加入isotype antibody，4℃孵育30分钟，用流式细胞仪检测上述DC表面分子。

1.3.7 自体混合淋巴细胞反应 (AMLR) 收集培养11天的DC，用25μg/ml的丝裂霉素C于37℃处置45分钟后，PBS洗涤3次，悬浮于完全RPMI1640培养基中，使DC的数量为1×104个细胞/孔加入96孔圆底培养板。用正常人DC作对照组，每组各3个复孔。每孔按照DC与淋巴细胞数量为1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例再加入复苏后的自体T淋巴细胞，终体积200μl/孔，并继续在37℃、5%CO2细胞培养箱混合培养5天。培养结束后，沉淀细胞吸出上清液，-20℃保存备检。加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃孵育4小时后，吸出液体 (剩余少许在孔内)，加入DMSO 100μl/孔，1小时后用酶标仪在550nm波长处测OD值。刺激指数 (SI)=试验孔OD值/空白孔OD值。

1.3.8 AMLR上清液中细胞因子的表达水平 分别收集纯的DC培养上清液和AMLR上清液，-20℃保存备检。ELISA法检测的细胞因子包括IL-10和IL-12，按照试剂盒提供的操作步骤进行。

1.4 统计学方法 数据用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析和配对t检验，用SPSS 13.0版软件系统分析。

2 结果

2.1 光镜下DC的形态特征和DC的增殖 PBMC培养2小时后见圆形扁平贴壁细胞;培养24小时后可见贴壁单核细胞均匀地分布成细胞聚体，粘附于培养板底，尤以边缘为著;加入细胞因子 (GM-CSF、IL-4)培养3～4天可见部分细胞呈梭形或不规则形状，第7天加入TNF-α后，细胞成簇现象增多，可以见到形状不规则、带有毛刺状突起的悬浮细胞，随着时间的延长，成簇的细胞团散开，在培养10～11天时即可以看到细胞表面有明显的毛刺状突起，即为具有典型DC形态的悬浮细胞。两组DC的体外增殖情况见图1。

图1 CHB患者组和对照组DC的体外增殖情况

2.2 治疗前后DC的细胞表型鉴定分析 培养11天的DC，直接用FITC标记的抗人MHC-II类抗原 (HLA-DR)、CD80、CD83和PE标记的抗人CD86单克隆抗体分别标记。用流式细胞仪分析显示:CHB患者HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达率普遍降低，其DC表达共刺激分子的水平明显低于正常人群 (P＜0.05)。治疗 24周后，两治疗组 HLA-DR、CD80、CD83、CD86表达率均较治疗前提高 (P＜0.05);补肾清毒法组HLA-DR、CD80、CD86表达率高于核苷类似物组(P＜0.05);CD83比较无统计学意义 (P＞0.05)。见表2。

表2 两组患者治疗前后与对照组DC表型表达比较 (，%)

表2 两组患者治疗前后与对照组DC表型表达比较 (，%)

2.3 DC刺激同种AMLR中T淋巴细胞增殖 采用自体淋巴细胞用于自体混合淋巴细胞反应中，健康人与CHB患者各5例，DC与自体淋巴细胞按照1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例混合培养，其刺激指数 (SI)分别为 (1.60±0.13)VS(1.23±0.05)、(2.20±0.14)VS(1.67±0.03)、 (1.46±0.15)VS(0.52±0.09)、(1.67±0.08)VS(0.62±0.15)。CHB患者DC刺激T细胞增殖的能力在各培养比例中均低于健康人，差异有统计学意义(P＜0.05)。且发现在1∶40的混合比例下，健康人和CHB患者的刺激指数均达到最高值，与本组其他混合比例比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。所以我们按照DC/T为1:40的比例进行余下实验。CHB患者经过24周的治疗，补肾清毒法组的刺激指数为1.277±0.17，核苷类似物组刺激指数为1.786±0.21，经治疗后两治疗组的刺激指数仍低于健康人，差异有统计学意义 (P＜0.05)。见图2。

图2 DC/T为1∶40时健康人、CHB患者治疗前、接受不同方法治疗后T淋巴细胞增殖比较

2.4 IL-10和IL-12的水平 AMLR上清液中健康人组IL-12水平高于CHB患者，差异有统计学意义 (P＜0.05)，而IL-10比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，见表3。接受治疗前，两组患者IL-12比较无统计学意义 (P＞0.05)。治疗12周后，核苷类似物组IL-12高于补肾清毒法组 (P＜0.05)。治疗24周后，两组分别与治疗前比较，IL-12有明显升高，比较有统计学意义 (P＜0.05)。而两组组间比较，无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表3 健康人与CHB患者治疗前AMLR上清液IL-12比较(，ng/ml)

表3 健康人与CHB患者治疗前AMLR上清液IL-12比较(，ng/ml)

表4 两组患者治疗前后AMLR上清液IL-12、IL-10比较(，ng/ml)

表4 两组患者治疗前后AMLR上清液IL-12、IL-10比较(，ng/ml)

3 讨论

“伏邪温病”则是指某些具有邪气伏藏，逾时而发，发时即表现为里热症状的温病。HBV具有垂直传染的特征，在围生 (产)期和婴幼儿时期感染HBV者中，分别有90%和25%～30%将发展成慢性感染，此当为先天肾虚不足所致。HBV感染慢性化过程与清代温病医家柳宝诒的“肾虚邪伏”学说所描述的相一致:即邪盛侵入机体，是因肾虚，邪伏于至虚之处，暗耗正气所致。而伏邪发病，往往是人体正气充盈鼓荡，或时气的引发。中医又有“肝肾同源”的理论，因此我们提出CHB发病机理为“肾虚疫毒内伏肝血”，故当采用补肾清毒的治疗方法。

DC是至今发现的人体内功能最强的专职抗原提呈细胞，也是惟一能激活纯真T淋巴细胞 (naive T cells)的抗原递呈细胞［8］，是机体免疫反应的始动者，在特异细胞免疫中起十分重要的作用。有研究表明，CHB患者体内DC功能受损，可能导致HBV感染慢性化［2，3］。近年来研究发现，CHB患者细胞免疫在辅助性T细胞 (Th)、DC及细胞因子等多方面均存在异常，与乙型肝炎慢性化有密切关系。

国内外的大量研究表明，CHB患者外周血DC数量减少、表型不成熟、功能下调，我们的实验也证实了CHB患者DC存在表型表达率下降的情况。DC分子表面标志的表达率可作为DC的抗原提呈能力的参考指标之一，要全面评价DC的功能是否得到恢复或者上调，单凭其表面标志的表达水平无法作出准确判断，而混合淋巴细胞反应是DC刺激增殖功能评价的一个常用技术。因此，我们还选用了自体混合淋巴细胞反应，目的是为了评价同一患者治疗前后或抗原负载的DC，对自体淋巴细胞的增殖是否具有增强作用。我们的研究表明，CHB患者经补肾清毒法和核苷类似物治疗24周后，HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达率均较治疗前升高 (P＜0.05)，但仍普遍低于健康人。DC表型的经典分子表面标志中的CD80和CD86是协同共刺激分子，为T/B细胞的活化提供重要的第二信号，在治疗24周后，补肾消毒法组 HLA-DR、CD80、CD86表达高于核苷酸类似物组 (P＜0.05)。同时，CHB患者经两种方法治疗后DC的刺激增殖指数 (SI)均有所升高，与治疗前比较差异有统计学意义 (P＜0.05)，但仍低于健康人的刺激指数 (P＜0.05)。由此，我们认为长期运用补肾清毒法较核苷类似物能更好的改善DC的表型，促进其提高抗原递呈能力［9］。

IL-12是DC细胞释放的最有效的CTL和自然杀伤细胞活性刺激因子，在机体抗病毒和抗肿瘤等一系列免疫病理条件下均能发挥关键作用。而IL-I0是一种抑制性细胞因子，它可以通过抑制DC分化成熟及抑制IL-12的分泌来降低DC的抗原提呈功能［10］。我们发现治疗前CHB患者IL-12水平较健康人低，而IL-10未见明显差异，结合DC的表型表达率特别是DC成熟的重要标志CD83的表达率和AMLR刺激指数的实验结果，说明CHB患者DC的成熟、抗原递呈能力和刺激T淋巴细胞增殖能力下降。经补肾清毒法治疗的CHB患者，IL-12水平上升趋势在治疗后期比较明显，提示补肾清毒法改善DC功能是一个长期的作用。同时，治疗前后CHB患者IL-10水平无明显改变，与IL-12变化未见明显相关性，提示外周血DC分泌IL-12下降及治疗后改善可能存在其他机制。有研究表明［11］，Treg可在体外诱导DC共刺激分子CD80和CD86的下调，且幅度非常明显，原因是Treg抑制了DC对T细胞增殖反应的诱导。另一研究发现［12］，Treg在HBV携带者外周血和肝脏活检标本中的水平明显高于HBV感染后自愈和健康人中的水平。认为Treg水平的增高可能与HBeAg的水平和HBV病毒载量有关。对于补肾清毒法是否能够影响Treg的功能及其水平，有待进一步研究。

本研究结果显示:补肾清毒法能改善DC的表型表达率和抗原递呈能力及其分泌功能，为补肾清毒法用于CHB的治疗和恢复CHB患者免疫功能提供了重要理论依据。同时也反证了CHB的中医发病机理是HBV在人体肾气不足，抗邪能力低下时侵袭人体，由于正气虚羸，不足以鼓荡邪气向外，而毒邪伏藏体内，邪郁日久则在风木之春季引动或劳累、卫外失司时邪气从里而发。此乃以药测证，以证求机 (病机)。

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