HBV感染恢复期血清标志物与肝细胞HBV cccDNA检测对照*

宋闽宁 黄文琪 闵 峰 洪美珠 范荣华 吴卫兵 张 丽 李伟杰

1.厦门大学附属成功医院感染科/中国人民解放军第174医院感染科 (福建厦门，361003)

2.中国人民解放军第302医院

慢性乙型肝炎 (CHB)抗病毒治疗是目前的主要治疗手段，作为主要抗HBV的核苷类由于有停药时间不易确定的不利因素，临床难以操作。为了解掌握理想的停药时机，将CHB患者不同血清学状况与肝组织HBV cccDNA进行检测对照，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 39例患者均为2008年4月至2010年4月在厦门大学附属成功医院就诊的住院及门诊患者。女9例，男30例，年龄平均56.2岁。其中13例为既往HBV感染自然恢复者，13例为乙型肝炎肝硬化肝癌患者，13例为CHB患者。诊断符合2010年中华医学会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准［1］，39例中的26例乙型肝炎肝硬化肝癌或CHB患者，正在接受抗病毒治疗的9例，曾接受抗病毒治疗3例，14例未接受抗病毒治疗。

1.2 方法

1.2.1 检测指标 住院患者于入院第二天收集患者血清标本做以下检测:HBV DNA用荧光定量PCR方法检测，试剂由达安公司提供。灵敏度为1000拷贝/ml。美国PE7000实时荧光扩增仪，低于1000拷贝/ml为检测值阴性统计。HBV-M检测试剂由新创公司提供。肝生化检测用美国全自动生化检测仪及配套试剂完成。CHB患者行肝脏穿刺组织活检。HBV感染自然恢复者及乙型肝炎肝硬化肝癌患者肝组织取自手术标本。

病理检查由我院病理科完成。

1.2.2 HBVcccDNA检测方法:①石蜡包埋组织切片HBV DNA的提取:甲醛固定石蜡包埋 (FFPE)组织切片时，严格防止交叉污染。经二甲苯及梯度酒精脱蜡后，通过试剂盒提取DNA，操作严格按照说明书进行。提取DNA储存于-20℃冰箱中备用。用试剂盒提取血清DNA储存于-20℃冰箱中备用。②PSAD酶消化:按照说明所述该酶所需环境及温度，设定反应体系为样品 DNA8.3μl，PSAD酶0.2μl，ATP solution 0.5ul，buffer1ul。反应条件为37℃30分钟，70℃灭酶活性30分钟。③滚环扩增 (Rolling circular amplification，RCA)反应:根据我国常见的HBV基因型B，C基因组全序列，设计引物共四对。反应体系与循环条件参照文献进行。跨缺口荧光定量PCR采用Taqman探针real-timePCR法，根据cccDNA结构特性，设计跨HBV缺口上下游引物Pup82，Pdown83和探针1，扩增长度为236bp，扩增产物为cccDNA。同时设计内参beta-actin的ta-up 3引物be，beta-down3和探针3，扩增内参 beta-actin基因。检测所需模板用量为 3μl，dNTP5μl，MgCl2，3.5μl，PCR buffer 2.5μl，相 应 引 物 及 Taq 酶 各0.5μl，剩余体积用双蒸水补足，总体系为25μl。反应时间仅1小时20分钟。标准曲线由自行构建的已知浓度的质粒DNA梯度稀释后建立。进行梯度稀释鉴定该方法的灵敏度，并对该方法进行批内和批间重复性检测。定量测出β-actin的量，除以6.667(单个肝细胞中所含有的β-actin量)，最后得出每个肝细胞中所含有的HBV cccDNA拷贝数。以检出单个肝细胞中所含有HBV cccDNA拷贝数为阳性。实验由中国人民解放军302医院肝炎中心完成。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件包分析，率的比较用卡方检验或Fisher's精确概率法;计量资料以表示，采用t检验。

2 结果

2.1 各组HBV血清标志物检测结果与肝细胞HBVcccDNA结果对照 见表1。将乙型肝炎肝硬化肝癌、CHB及既往HBV感染各组HBV血清标志物 (HBV-M)相对照;结果显示肝癌及CHB患者e抗体阳性分别为12/13例:9/13例，血HBV DNA阳性分别为6/13例:8/13例，但肝细胞HBVcccDNA均检出阳性 (100%)。既往乙肝病毒感染13例中，HBsAg阴性，抗HBs及/或抗HBc阳性各7和6中，仍有3例 (23%)肝细胞中HBVcccDNA阳性。与另两组对照，χ2等于5.5(P＜0.01)。具显著差异。

表1 3组患者血清HBV-M与肝组织HBV cccDNA比较［%(n)］

2.2 血清HBV-M与肝脏HBV cccDNA总量与细胞定量比较见表2。将既往HBV感染患者血清标志物存在状况与肝组织HBV cccDNA定量对比，抗-HBs阳性组7例，肝组织HBV cccDNA总量102拷贝/ml，低于抗-HBe阳性及抗-HBs阳性组的106拷贝/ml和105拷贝/ml，t=3.7、3.3(P＜0.05)，有显著差异。抗-HBs阳性组肝细胞HBVcccDNA阴性，而抗-HBe阳性并有抗HBs阳性组分别为105拷贝/ml和103拷贝/ml，与前者比较，t=4.5、4.0(P＜0.01)，差异有非常显著性意义。

表2 血清HBV-M与肝组织HBV cccDNA总量与细胞定量比较(copies/ml，，μg/L)

表2 血清HBV-M与肝组织HBV cccDNA总量与细胞定量比较(copies/ml，，μg/L)

与抗-HBs阳性比较，*P＜0.05(t=3.7、3.3)，＊＊P＜0.01(t=4.5、4.0)

2.3 HBV感染清除期血清标志物与CHB治疗应答组肝组织HBV cccDNA比较 见表3。将既往HBV感染恢复期血清13例，HBsAg及HBV DNA均阴性，其中e抗体阳性6例，余为抗HBc阳性。肝组织HBV cccDNA阳性3例。CHB核苷类治疗后应答，尽管HBV DNA阴性，e抗体阳性，肝组织HBV cccDNA仍均检出阳性。

表3 既往HBV感染与CAH治疗应答血清标志物与肝组织HBVcccDNA对比［n(%)］

3 讨论

我国慢性乙型肝炎人数众多，抗病毒达到我国CHB防治指南建议的治疗终点后停药容易复发，目前提倡长时间服药，但核苷类长期用药又难免发生耐药。cccDNA是HBV前基因组RNA复制的原始合成模板，是HBV持续感染的关键因素。HBV感染宿主肝细胞后，其基因组进入肝细胞先生产HBV cccDNA，然后以HBV cccDNA为模板转录装载成HBV rcDNA释放入血。目前的抗病毒药对其影响甚微。检测肝组织HBV cccDNA对HBV的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义［1］，可在一定程度上了解患者病情进展，对抗病毒药物疗效进行判断，确定治疗终点。

应用石蜡包埋组织切片DNA及血清DNA的提取技术，敏感的滚环扩增反应结合实时PCR扩增技术［2］，研究模版消亡时间与机制的关系，寻求预测血清学及组织复发及停药指征。将CHB患者核苷类抗病毒治疗前、应答后肝组织HBV cccDNA与HBeAg转阴或转换及HBV DNA的关系进行研究，结果显示:既往HBV感染13例，抗-HBs及抗-HBc阳性各7和6例中，HBsAg阴性，仍有3例肝细胞中HBV cccDNA阳性。抗-HBs阳性组，肝细胞HBV cccDNA阴性，低于抗-HBe阳性及抗-HBs阳性组，χ2等于5.5(P＜0.01)，具有显著差异。抗-HBs阳性组肝组织HBV cccDNA总量，低于抗-HBe阳性及抗-HBs阳性组，t=3.7、3.3(P＜0.05)，有显著差异。抗-HBs阳性组肝细胞HBV cccDNA检测阴性，亦低于抗-HBe阳性及抗HBs阳性组，t=4.5、4.0(P＜0.01)，差异非常显著。CHB核苷类治疗后全应答，尽管HBV DNA阴性，抗-HBe阳性，肝组织HBV cccDNA仍均为阳性。HBsAg及HBV DNA均阴性的既往HBV感染者，肝组织HBV cccDNA阳性仍占23%。本研究的既往HBV感染组系自然恢复病例，CHB抗病毒治疗应答病例目前难以达到类似临床效果。

本研究资料显示:血清HBsAg与肝组织HBV cccDNA具良好相关性［3～4］。目前我国乙肝抗病毒治疗主要以干扰素及核苷类两种类型，国外多个慢性乙型肝炎治疗指南已建议以HBsAg阴转为治疗终点。而我国实际国情是无论何种抗病毒药HBsAg阴转率均不高，因此，应长程抗病毒治疗。不能达成HBsAg阴转的病例，治疗终点就无法界定［5～6］，复发及耐药在所难免。治疗及复发交错的总病程可能最终的结果是肝脏病理损害的逐渐加重。

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