海金子中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁的分离及含量测定

彭一波，刘 阳，李 娜，刘玉琴，谢 谊，王实强

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙410013）

海桐花科（Pittosporaceae） 海桐花属（Pittosporum Banks）植物海金子（Pittosporum.illicioides Mak.）分布于福建、浙江、江苏、安徽、江西、湖北、湖南、贵州等省，国外产地有日本[1]。海金子的根民间用于风湿性关节炎、坐骨神经痛、骨折、胃痛、牙痛、高血压及神经衰弱，还具有良好的杀精子作用[2-3]。海金子叶可用于蛇咬伤，疮疖肿毒，过敏性皮炎和外伤出血[3]。海金子的干燥种子称为“山枝仁”，被贵州和四川两省的地方标准收载，具有清热利湿、生津止咳、收敛止泻的功效。用于心烦，口渴咽痛，痢疾，肠炎，白带，体倦乏力等[4-5]。海金子在四川几乎都为野生，多生长在悬崖峭壁或斜坡上，采集十分困难，加上利润微薄，少有人愿意采集，导致商品来源不足。

为了更深入地研究海金子的活性物质，从海金子叶中提取、分离得到活性化合物柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁，这两种化合物在海金子中首次发现。目前关于海金子中这两种化合物的高效液相色谱分析方法未见文献报道。本文建立了快速预处理、分离效果好的高效液相色谱分析法，测定不同采集时间、海金子不同部位两种化合物的含量。为开发和利用海金子提供参考依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

岛津LC-10ATvp 高效液相色谱仪（日本岛津公司），N2000 双通道色谱工作站 （浙江大学智能信息工程研究所）；岛津UV-2450 型紫外分光光度仪（日本岛津公司）；INOVA-400 核磁共振仪 （Varian 公司）；Avatar 370 FT-IR 型红外光谱仪（Thermo Nicolet 公司）；LCQ Advantage 型质 谱 仪（Thermo Finnigan 公司）；C10558 型TLC visualizer 成像仪（瑞士卡玛公司）；SZ-93A 双蒸馏水器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ2200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240 型分析天平 （METTLER 公司）。

1.2 药品与试剂

柽柳素-3-O-芸香糖苷对照品（自制），HPLC 测定含量大于98%；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号100080-200707）；甲醇、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。海金子样品由课题组成员从保靖、吉首、花垣采集，经湖南省中医药研究院中药研究所生药室鉴定，为海金子（Pittosporum.illicioides Mak.)全草，取其叶、茎皮、果实阴干，供样品含量测试用。

2 方法与结果

2.1 提取分离

将海金子（花垣8月）叶（500 g）的70%乙醇提取物，依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取，回收正丁醇得提取物（3.5 g）。采用硅胶柱进行分离，从石油醚∶乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗脱液中得到深黄色颗粒状晶体，重结晶得化合物Ⅰ（约200 mg），从乙酸乙酯∶甲醇=（4∶1，V/V） 洗脱液中得到黄色粉末状结晶，重结晶得化合物Ⅱ（约300 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物Ⅰ进行UV、1H-NMR、13C-NMR、ESIMS、IR 光谱鉴定，化合物Ⅱ进行UV、TLC、HPLC 鉴定。

2.2.1 化合物Ⅰ的波谱数据及鉴定

UV λMeOmaxHnm(logε):254(4.32)，356(4.26)，可初步判断有黄酮化合物基本母核。

ESI -MS m/z：623 [M -H]-。IRνKBrmax/cm：3382，1652，1604，1500，1452，1360，1291。

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.44（d，1H，J=1.6 Hz，H-6），6.21 （d，1H，J=1.6 Hz，H-8），7.86（d，1H，J=1.2 Hz，H-2′），7.52（dd，1H，J=8.4 Hz，1.2Hz，H-6′），6.91（d，1H，J=8.4 Hz，H-5′），3.84（s，3H，4′-OCH3），5.44 （d，1H，J=7.2 Hz，glc-H-1＂），3.22～3.41（m，6H，glc-H-2＂～6＂），0.98 （d，3H，J=6.0 Hz，rha-CH3）。

13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.8（C-2），133.3（C-3），177.7(C-4)，161.5（C-5），99.0（C-6），164.4（C-7），94.1（C-8），156.8（C-9），104.3（C-10），121.4（C-1′)，113.6（C-2′），147.2（C-3′），149.7（C-4′），115.6（C-5′），122.6（C-6′），101.5（C-1＂），76.7（C-2＂），76.2（C-3＂），70.6（C-4＂），74.6（C-5＂），67.1（C-6＂），101.2（C-1＇＇＇），70.4（C-2＇＇＇），70.9（C-3＇＇＇），72.1（C-4＇＇＇），68.6（C-5＇＇＇），18.0（C-6＇＇＇）。以上波谱数据与柽柳素-3-O-芸香糖苷的文献数据[6]一致，故鉴定为柽柳素-3-O-芸香糖苷。

2.2.2 化合物Ⅱ的结构鉴定

薄层鉴别：取化合物Ⅱ10.1 mg，用甲醇定容至10 mL，制成化合物Ⅱ溶液；取芦丁对照品10.5 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，即得芦丁对照品溶液。照薄层色谱法[7]试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，分别以不同的展开剂展开：（1）二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（15∶7∶0.5）；（2）三氯甲烷∶甲醇∶水（2∶1∶0.3）下层20 mL 加甲酸0.2 mL；（3）三氯甲烷∶丙酮∶冰醋酸（2∶1.5∶0.2）。展距为15 cm，取出，晾干。置紫外光灯（365 nm）下检视。结果化合物Ⅱ溶液的色谱中，在与芦丁对照品相应的位置处显黑色斑点。

紫外鉴别：向化合物Ⅱ的甲醇溶液（26.8 μg/mL）分别加入甲醇钠、乙酸钠、乙酸钠/硼酸、三氯化铝及三氯化铝/盐酸诊断试剂，试验数据（λmaxnm）：256，266 sh，296 sh，358 （MeOH）；272，328，410 （NaOMe）；272，302 sh，420 （AlCl3）；268，300，366 sh，398（AlCl3/HCl）；272，324，382 （NaOAc）；262，298，378（NaOAc/H3BO3）。将上述各种UV 图谱与文献[8]比较，结果与芦丁一致。

高效液相色谱鉴别：取芦丁对照品适量，制成100 μg/mL 对照品溶液；取化合物Ⅱ适量，制成100 μg/mL 的化合物Ⅱ试液，在“2.3.1”色谱条件下分别检测。发现化合物Ⅱ与芦丁对照品在相同的保留时间（15.4 min）出峰。综上，化合物Ⅱ鉴定为芦丁。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性 采用Agela Technologies Promosil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（34∶66）；流速为1.0 mL/min；检 测 波 长 为254 nm；柱 温 为40 ℃；理论塔板数按柽柳素-3-O-芸香糖苷计不低于5 000。结果见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备 称取柽柳素-3-O-芸香糖苷对照品和芦丁对照品适量，精密称定，用50%甲醇溶解并定量稀释成含柽柳素-3-O-芸香糖苷100 μg/mL，芦丁100 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 药材粉碎（过一号筛），取粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷至室温，用50%甲醇补足失去的质量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液即得。

图1 对照品（A）及海金子药材叶（花垣8月）供试品（B）HPLC 图

2.3.4 线性关系的考察 精密称取柽柳素-3-O-芸香糖苷对照品和芦丁对照品适量，用50%甲醇分别配成每1 mL 含柽柳素-3-O-芸香糖苷0.254 4 mg和每1 mL 含芦丁0.340 8 mg 的2 份母液，分别吸取柽柳素-3-O-芸香糖苷母液2、3、5、7、9 mL于10 mL 容量瓶；分别吸取芦丁母液2、3、5、7、9 mL 于10 mL 容量瓶，用50%甲醇稀释至刻度。分别吸取以上10 个稀释液和2 个母液各5 μL 注入液相色谱仪。以对照品进样量（μg）为横坐标，色谱峰面积积分值（mv）为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表1。

表1 柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁的线性关系考察

2.3.5 精密度实验 精密吸取海金子（花垣8月）叶供试品溶液，按上述色谱条件和测定方法，连续进样6 次，以柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁峰面积积分值计算，RSD 分别为1.71%和1.82%，结果表明本法精密度良好。

2.3.6 稳定性实验 精密吸取同一份海金子（花垣8月）叶供试品溶液，按上述色谱条件和测定方法，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 进样，测定色谱峰面积，以柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁峰面积积分值计算，RSD 分别为1.52%和1.73%，结果表明供试品在12 h 内基本稳定。

2.3.7 重复性实验 按“2.3.3”方法制备海金子（花垣8月）叶样品5 份，在“2.3.1”色谱条件下分析，测得柽柳素-3-O-芸香糖苷的平均含量为0.54%，RSD为1.76%，芦 丁 的 平均 含 量 为0.47%，RSD 为1.34%，结果表明该方法重现性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁含量的海金子（花垣8月）叶粉末（过一号筛）12 份，每份0.25 g，分两组，一组精密加入柽柳素-3-O-芸香糖苷，另一组精密加入芦丁对照品适量，按“2.3.3”方法制备待测液，各精密吸取5 μL 进样，在“2.3.1”色谱条件下分析测定，计算回收率。测定结果见表2～3。

2.3.9 样品含量测定 取不同采集时间的海金子叶、茎皮、果实的粉末（过一号筛），按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，依照“2.3.1”色谱条件测定，采用外标法计算含量，结果见表4。

表2 柽柳素-3-O-芸香糖苷回收率试验 （n=6）

表3 芦丁回收率试验 （n=6）

表4 不同采集地、时间海金子叶、茎皮、果实中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁含量 （n=2，%）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

色谱柱：本实验分别使用了伊利特Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 柱，Agela Technologies Promosil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm) 柱，Waters Symmetry C18(3.9 mm×150 mm，5 μm)柱，发现 Agela Technologies Promosil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)柱，分离情况较好。

流动相的选择：甲醇-0.2%磷酸[9]，拖尾，适当增加磷酸百分含量，甲醇-0.4%磷酸，峰形好。摸索流动相比例，甲醇-0.4%磷酸水溶液（34∶66），分离情况较好。

检测波长的选择：柽柳素-3-O-芸香糖苷的紫外光谱图有两个特征吸收峰，最大吸收波长分别为254 nm 和356 nm。因254 nm 处 的ε 值 大 于356 nm 处的ε 值，故选用254 nm 为检测波长。

柱温的选择：比较柱温30、35、40 ℃时的色谱图，在40 ℃时分离度符合要求、理论塔板数较高。

3.2 样品处理方法的选择

提取溶剂考察：取海金子（花垣8月）叶粉末（过一号筛），8 份，每份0.5 g，分别用不同的溶剂提取：95%、70%、50%、20%乙醇及100%、70%、50%、20%甲醇，其他提取和测定条件相同。测得样品含量，结果50%甲醇提取最完全。

提取方法考察：取海金子（花垣8月）叶粉末（过一号筛），2 份，每份0.5 g，分别回流、超声30 min，其他提取和测定条件相同。测得样品含量，结果超声效果比回流好。

提取时间考察：取海金子（花垣8月）叶粉末（过一号筛），4 份，每份0.5 g，分别超声20、30、45、60 min 放冷，其他提取和测定条件相同。测得样品含量，结果30 min 样品可提取完全。

3.3 结果分析

芦丁结构鉴定中，由于有中检所对照品提供，采用液相色谱结合薄层色谱进行鉴别，比照样品与对照品的保留时间与Rf 值确定该化合物为芦丁；而柽柳素-3-O 芸香糖苷无法定对照品，故选用波谱技术进行结构鉴定。

从表4中可以看出海金子叶、茎皮、果实中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁含量差异显著，两个化合物叶含量最高；不同采集时间海金子柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁含量差异显著，其中柽柳素-3-O-芸香糖苷8月含量较低，芦丁3月含量较低。本文采用HPLC 测定几个不同采集时间海金子叶、茎皮、果实中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁的含量，为海金子的开发利用提供了实验依据。

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