杨树菌材与传统菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱研究

林亲雄，邓旭坤，陈旅翼，杨 凤

(1中南民族大学药学院，武汉430074;2远安县森林病虫害防治所，宜昌444200)

天麻(Gastrodia elata Blume)为兰科植物的干燥根，别名赤箭、定风草、明天麻.历史悠久，久负盛名，与冬虫夏草、人参、灵芝等共称为历史名贵中药材，是国家公布的34种名贵药材品种之一.用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐［1］.现代药理研究表明天麻对中枢神经系统、心血管系统有药理活性，能耐缺氧、增强免疫力等［2］.

20世纪90年代后，天麻应用于中成药及保健品的开发，需求量逐年递增.天麻种植规模不断扩大，为人工种植天麻，每年要消耗大量生长缓慢的栗树、栎树等林木资源，随着天然林保护工程和生态林业建设的实施，传统菌材来源不足，寻求新的天麻替代栽培材料十分迫切.杨树栽培天麻具有菌丝生长快，天麻生长期长、产量高等优点［3，4］，但杨树栽培天麻的特点和质量评价，较传统菌材栽培天麻的优势，目前尚未见相关报道.除天麻素与天麻多糖2种主要活性成分［5］外，天麻的其他药效成分尚未明确.本研究在比较杨树菌材与传统菌材栽培天麻的天麻素与天麻多糖含量基础上［6］，通过测定不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱，分析其物质组成的特点与差异，为杨树菌材栽培天麻的质量评价提供理论依据和技术支持.

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

天麻样品采自宜昌下堡坪乡、五峰药材所、鹤峰长乐坪乡3个实验点的杨树、栎树、栗树3种不同菌材栽培的成品天麻.天麻素标准品(百灵威化学技术有限公司)，高效液相用甲醇为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯.

高效液相色谱仪(Angilentl100，安捷伦科技有限公司)，电子天平(BS224S型，德国赛多利斯公司)，高速离心机(TGL-16C型，上海嘉鹏科技有限公司)，超声波清洗器(KQ-500DE数控，昆山市超声仪器有限公司)，真空干燥箱(DZF6020，上海一恒仪器厂).

1.2 天麻素标准品溶液制备

将天麻素标准品以80℃真空干燥1 h，精密称取天麻素，用甲醇配制成1 mg/mL天麻素标准品溶液，0.45 μm 滤膜过滤.

1.3 天麻HPLC指纹图谱待测样品液的制备

［7-8］优化样品液制备方法:将新鲜天麻置80℃烘箱干燥5 h，粉碎过60目标准筛，精密称取0.5 g样品，加60%的甲醇10mL密封，70℃，400w 功率超声提取1 h，6000 g 离心5 min，0.45 μm滤膜过滤上清，取滤液作为待测样品.

1.4 天麻HPLC指纹图谱测定的色谱条件

色谱柱:NUCLEOSILC18(4.6mm ×250mm，5 μm);理论塔板数n=10620;柱温:25℃;波长:221 nm;进样量:20 μL;流速:1 mL/min;流动相A:0.1%磷酸水，流动相B:含0.1% 磷酸的甲醇.

1.5 天麻HPLC指纹图谱的测定

优化文献［8］的梯度洗脱程序为0～15 min，2%(B);15～60 min，2%～45%(B)，调整流动相 B浓度，延长梯度洗脱时间得:0～15 min，2%(B);15～65 min，2%～45%(B);65～70 min，45%～65%(B);70～80min，65%～85%(B);80～90 min，85%～85%(B);90～100min，85%～100%(B);100～105min，100%～100%(B);105～115 min，100%～2%(B);115～120 min，2%(B).设置图谱参数仅显示主峰(峰面积＞0.335 mV/min)，通过标准品峰确定天麻素峰的位置与含量，每样品重复3次，取平均值.

1.6 数据处理

天麻HPLC指纹图谱测定数据采用Excel软件进行组间平均值的差异显著性t检验.

2 结果

2.1 不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱的测定结果

三地不同菌材栽培天麻样品的HPLC指纹图谱测定结果如表1所示.由表1可见，杨树、栎树、栗树菌材栽培天麻HPLC指纹图谱的主峰数与天麻素峰面积差异不显著，主峰总面积杨树菌材与栎树菌材差异不显著，但与栗树菌材差异不显著;相同菌材不同栽培地区之间天麻HPLC指纹图谱的主峰数、主峰总面积、天麻素峰面积差异较大.

表1 不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱结果Tab.1 The HPLC fingerprints results of Gastrodia elata Blume cultivated with different traditional materials

2.2 下堡坪、五峰和鹤峰不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱

下堡坪天麻素对照品的HPLC图谱、下堡坪不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱如图1所示.由图1可知，杨树、栎树、栗树天麻的HPLC指纹图谱很相似，各特征峰(紫外吸收值大于20mV)的数量与分布一致，杨树和栎树天麻特征峰的紫外吸收强度相近，但两者均弱于栗树，表明栗树天麻成分含量较高.杨树和栎树天麻的天麻素含量基本一致，但明显低于栗树天麻.

五峰不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱如图2所示.由图2可见，与下堡坪相似，特征峰的数量与分布基本一致，杨树和栎树菌材各特征峰的紫外吸收强度相近，但两者均明显弱于栗树，表明栗树天麻成分含量较高.此外，五峰天麻各特征峰的紫外吸收强度弱于下堡坪，显示下堡坪天麻成分含量高于五峰，两地天麻各成分的含量存在较大差异.

图1 下堡坪杨树、栎树、栗树栽培天麻的HPLC指纹图谱Fig.1 The HPLC fingerprints of Gastrodia elata Bl.cultivated with popular，oak and chestnut materials in Xiabaoping Country

图2 五峰杨树、栎树、栗树栽培天麻的HPLC指纹图谱Fig.2 The HPLC fingerprints of Gastrodia elata Bl.cultivated with popular，oak and chestnut materials in Wufeng Country

鹤峰不同菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱如图3所示.由图3可见，3种菌材主要峰的数量、分布基本一致，吸收强度相近，但与下堡坪、五峰天麻的HPLC指纹图谱存在较大差异，鹤峰天麻HPLC指纹图谱中保留时间为47.9min的特征峰紫外吸收强度显著强于下堡坪和五峰，而保留时间为56.3，63.5 min等特征峰的吸收强度显著低于下堡坪、五峰.因此，鹤峰天麻的主要物质成分含量与下堡坪、五峰天麻存在较大差异.

图3 鹤峰杨树、栎树、栗树栽培天麻的HPLC指纹图谱Fig.3 The HPLC fingerprints of Gastrodia elata Bl.cultivated with popular，oak and chestnut materials in Hefeng Country

3 结语

本文优化了HPLC梯度洗脱程序，测定了来自湖北下堡坪、五峰、鹤峰的不同菌材栽培的天麻的HPLC指纹图谱.结果表明:天麻在不同地点、不同菌材的HPLC指纹图谱主峰数量和分布相似;同一种菌材在不同地点的HPLC指纹图谱存在明显差异.五峰和下堡坪的不同菌材的天麻HPLC指纹图谱差异均较大，鹤峰差异较小.总体上，杨树菌材栽培天麻的HPLC指纹图谱与栎树相近，但各特征峰的吸收强度明显弱于栗树，故杨树菌材栽培天麻的主要成分的种类与传统菌材栽培天麻基本一致，成分含量与栎树相似，但低于栗树.

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:1部［M］.北京:化学工业出版社，2005:39.

［2］张兰珍，郭亚健，石任兵，等.天麻化学与药理研究［C］//中国科学技术协会.提高全民科学素质、建设创新型国家:2006中国科协年会论文集.北 京:中国科学技术协会，2006.

［3］程 琼，张启东，田开清，等.杨树种植天麻试验研究初报［J］.湖北林业科技，2007(4):29-30.

［4］杨志兵，陈代雄，林亲雄，等.树菌材与传统菌材栽培天麻的实验研究［J］.中南民族大学学报:自然科学版，2011，30(3):42-44.

［5］王 伦，张兴国，李晓倩.天麻主要活性成分及其结构修饰研究［J］.湖北农业科学，2010，49(5):1146-1149.

［6］林亲雄，林正保，杨志兵.杨树菌材栽培天麻的质量研究［J］.中药材，2012，34(12):1827-1829.

［7］孙国祥，王 真.用HPLC指纹图谱宏观全定性全定量评价天麻质量［J］.中南药学，2009，7(3):216-219.

［8］徐自升，张 弦，李泽友，等.安徽金寨产天麻药材HPLC指纹图谱的研究［J］.安徽医药，2007，11(3):200-201.