头针对脑缺血再灌注大鼠脑微血管Ⅳ型胶原蛋白影响的动态研究*

于学平，孙晓伟，邹 伟

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040)

近年来脑缺血再灌注过程中血脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)破坏已成为缺血再灌注损伤研究的一个热点。脑微血管基底膜是BBB的重要结构之一，当BBB的结构或功能的完整性损伤、通透性增强时，往往以微血管基底膜损伤最为重要。头针作为治疗缺血性脑血管病的一种有效方法，其对脑缺血再灌注后BBB保护作用方面的研究甚少，而有关脑微血管基底膜中Ⅳ型胶原蛋白的相关研究更是未见报道，因此，本研究通过脑缺血再灌注大鼠模型，观察头针干预后不同时间点脑微血管基底膜Ⅳ型胶原蛋白的动态变化，以明确头针治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组

选取SD健康雄性大鼠130只(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，体重280～300 g。随机分为假手术组、模型组和针刺组。假手术组30只大鼠，其余两组每组再随机分为 MCAO2h/R4h、MCAO2h/R12h、MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h 和 MCAO2h/R72h等5个亚组，每个亚组10只大鼠，其中5只用来做免疫组化检测，5只用来做ELISA检测。

1.2 模型制备

参照改良的Zea Longa线栓法，制成大鼠右侧大脑中动脉缺血2 h再灌注模型(MCAO/R)。术后大鼠左侧肢体偏瘫:提尾悬空时左上肢不能伸展或行进时向左侧倾倒、向左侧旋转，表明造模成功。

1.3 干预方法

针刺组从百会穴进针，刺向右侧曲鬓穴，进针约0.8寸，以200 r/min速度捻转5 min，留针30 min，期间捻转2次。假手术组和模型组大鼠，每天在针刺组治疗时间内，均要抓取并固定1次，每次30 min，以保证与针刺组大鼠具有相同的饲养条件。

1.4 指标检测

1.4.1 Ⅳ型胶原免疫组化测定 在相应时间点灌注处死大鼠，断头取脑，石蜡包埋。脑组织石蜡切片经脱腊、水化，3%H2O2抑制内原性过氧化物酶，1%牛血清白蛋白封闭，滴加ColIV一抗，4℃过夜。滴加生物素标记的二抗，37℃温育30 min。滴加过氧化酶－链霉卵白素，37℃温育30 min。DAB显色液显色。苏木素复染、封片。

1.4.2 Ⅳ型胶原ELISA测定 在相应时间点处死大鼠，迅速断头取脑。将脑组织在冰浴中匀浆，提取蛋白。ELISA法检测脑组织中Ⅳ型胶原含量的操作，严格按照试剂盒说明进行。

1.5 统计学方法

运用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织Ⅳ型胶原免疫组化染色结果

在光学显微镜下，Ⅳ型胶原蛋白在各组大鼠脑组织中主要沿血管内壁呈阳性表达。假手术组:Ⅳ型胶原的表达丰富、连续，可见沿毛细血管内壁一周强阳性染色，在大血管中更为明显。模型组:可见梗死灶周围区的Ⅳ型胶原表达，与假手术组比较明显减弱。再灌注4 h时血管扭曲变形，但Ⅳ型胶原沿血管的表达仍呈连续状态;再灌注12 h，Ⅳ型胶原的表达明显减弱，沿血管呈间断表达;再灌注24～48 h，Ⅳ型胶原的表达降低最为显著，仅沿血管呈少量散在点状阳性染色;72 h组Ⅳ型胶原的表达量开始增加，连续表达与间断表达Ⅳ型胶原的血管并存。头针组大鼠在再灌注4 h、12 h梗死灶周围区的Ⅳ型胶原表达与模型组相似;随着针刺时间的延长和针刺次数的增加，再灌注24 h、48 h、72 h与模型组相比，梗死灶周围区Ⅳ型胶原表达有所增加，但仍低于假手术组表达。

2.2 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织Ⅳ型胶原蛋白表达的ELISA检测结果

表1 3组大鼠缺血侧脑微血管Ⅳ型胶原蛋白表达含量比较(±s)

表1 3组大鼠缺血侧脑微血管Ⅳ型胶原蛋白表达含量比较(±s)

注:与相应时间点假手术组比较，△P＜0.05;与相应时间点模型组比较，★P＜0.05。

IR4h IR12h IR24h IR48h IR72h假手术组 3 0.97 ±0.04 0.92 ±0.03 0.90 ±0.04 0.90 ±0.03 0.组别 例数94 ±0.02模型组 5 0.86 ±0.02△ 0.79 ±0.04△ 0.53 ±0.01△ 0.49 ±0.02△ 0.59 ±0.02△针刺组 5 0.88 ±0.01△ 0.81 ±0.02△ 0.65 ±0.02△★ 0.58 ±0.02△★ 0.69 ±0.01△★

由表1可看出，大鼠脑缺血再灌注后的不同时间点缺血侧脑微血管Ⅳ型胶原蛋白含量:模型组、头针组均较假手术组明显减低，具有显著性差异(P＜0.05)。模型组大鼠在再灌注后4 h，缺血侧脑组织中Ⅳ型胶原蛋白含量即明显减低;且持续减少，至再灌注24～48 h，水平最低;随后其含量开始升高，再灌注后72 h，其含量为0.59±0.02，但仍明显低于假手术组(P＜0.05)。针刺组与模型组比较，头针组大鼠在再灌注后各时间点缺血侧脑组织中Ⅳ型胶原蛋白含量均有所升高，并逐渐增加，至再灌注后24 h、48 h、72 h升高最为明显，与相应时间点的模型组相比，具有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

血脑屏障(BBB)是位于脑组织与血液之间的一个屏障结构，主要由血管内皮细胞及其紧密连接(TJ)、血管基底膜和星形胶质细胞终足组成。脑缺血再灌注损伤可引起BBB破坏，而BBB破坏是导致缺血再灌注后脑水肿和炎症反应等病理变化的重要环节[1]。基底膜作为毛细血管的支持结构，Ⅳ型胶原(ColIV)和层连蛋白(LN)是基底膜的主要成分，在这一病理过程中尤为重要。Hamann等发现局部脑缺血再灌注24 h后，脑微血管基底膜层连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原等表达均明显减少，基底膜抗原也同步消失，说明脑缺血再灌注后存在脑微血管基底膜损害[2]。李玲等通过观察脑缺血再灌注损伤过程中基底膜的动态变化，发现再灌注12 h至3天时，脑水肿和脑出血最为严重;再灌注12 h至7天，脑微血管基底膜大片脱落、溶解、缺损，Ⅳ型胶原与层连蛋白抗原明显减少至消失，并与脑水肿、出血部位相一致。认为基底膜破坏的根本原因是Ⅳ型胶原、层连蛋白等成分的减少[3]。可见Ⅳ型胶原作为构成微血管基底膜的主要物质之一，是维持BBB完整性的重要结构基础，寻求其有效的干预方法，对脑缺血再灌注损伤的防治将具有重要的临床价值。

本研究采用改良的Zea Longa线栓法制备脑缺血/再灌注(MCAO/R)模型，运用免疫组化与 ELISA检测方法，从蛋白定性及定量的不同角度，检测缺血再灌注后不同时相点MCAO/R模型大鼠梗死区血管内壁Ⅳ型胶原阳性细胞表达的情况，两种方法得出结论是一致的:缺血侧脑组织中Ⅳ型胶原含量于再灌注4 h即开始减低，12 h明显降低，24 h～48 h时降解达到高峰，随后有所增加，此结果与笔者前期相关研究中所观察到的脑梗死体积、脑水含量、BBB结构和通透性以及 MMP －9 的动态变化相一致[4～5]，从而证明了Ⅳ型胶原蛋白表达的减少与脑缺血再灌注后BBB的破坏和继发性脑损害密切相关。

本研究发现针刺组大鼠再灌注后各时间点梗死灶周围区Ⅳ型胶原的表达均较模型组增加;于再灌注后24 h、48 h、72 h，Ⅳ型胶原蛋白表达加强最为明显，具有统计学差异(P＜0.05)。此结果与前期有关针刺与脑水含量及细胞外基质蛋白酶MMP－9的研究结果相吻合:针刺组大鼠在再灌注24 h、48 h、72 h，脑组织水含量较模型组显著降低;再灌注各时间点头针组大鼠缺血侧脑组织 MMP－9表达较模型组显著减少[4～5]。从而得出结论:早期进行头针干预治疗能上调缺血侧脑组织中Ⅳ型胶原蛋白的表达，并随着针刺治疗时间的延长，其效果明显提高，其机理可能与下调内源性MMP－9表达，减轻其对Ⅳ型胶原蛋白的降解有关。说明上调Ⅳ型胶原蛋白的表达，加强毛细血管基底膜的支持作用，保护BBB的完整性，可能是头针治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制之一。

[1]海舰，丁美修.脑缺血再灌注时血脑屏障损伤的炎性机制[J].国外医学·脑血管疾病分册，2001，9(1):15－18

[2]Hamann GF，Okada Y，Fitridge R，et al.Microvascular basal lamina antigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J].Stroke，1995，26:2120 －2126

[3]李玲，黄如训，张小燕，等.局部脑缺血再灌注病灶区脑微血管基底膜及其成分改变的实验研究[J].中华老年医学杂志，2000，19(5):364－367

[4]孙晓伟，于学平，于春林，等.头针对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障影响的实验研究[J].针灸临床杂志，2011，27(6):66 －69

[5]孙晓伟，于学平，李洪涛，等.头针对脑缺血再灌注大鼠脑组织MMP－9表达调控的动态研究[J].中医药学报，2011，39(3):107－110