响应面设计法优化仙鹤草总多酚的超声提取工艺

徐秀泉，李 峰，汤 建，许 源

1江苏大学药学院，镇江212013;2江苏大学附属医院，镇江212001

响应面设计法优化仙鹤草总多酚的超声提取工艺

徐秀泉1*，李 峰2，汤 建1，许 源1

1江苏大学药学院，镇江212013;2江苏大学附属医院，镇江212001

在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对影响超声辅助提取仙鹤草总多酚得率的主要因素(超声温度、料液比和乙醇浓度)进行优化，建立了影响因素与总多酚之间的函数关系。获得最佳工艺条件为:71%乙醇，料液比1∶24，超声提取温度60℃，提取时间20 min。在此最佳条件下，总多酚得率为3.56%，试验结果与模型预测值相符。

仙鹤草;总多酚;超声提取;响应面设计法

植物多酚是植物次生代谢产物中的重要类型之一，主要由黄酮、单宁等物质构成，因其具有显著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突变活性而引起人们的广泛关注［1］。仙鹤草为蔷薇科龙芽草属植物龙芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的全草，在我国具有悠久的药用历史，主要用于治疗衄血、咯血、尿血、便血、崩漏等各种出血证［2］。其中酚类物质为仙鹤草酚A～E，山萘酚、槲皮素及其苷类是其抗氧化、抗炎、抗肿瘤的主要有效成分［3，4］，因此研究仙鹤草多酚化合物的提取工艺对仙鹤草的深入开发利用具有重要的意义。

近年来，陈优生［5］等采用正交设计法优化了仙鹤草总黄酮的提取工艺，赵立芳［6］等采用单因素实验法考察了影响仙鹤草鞣质提取得率的主要因素，为中药材仙鹤草的利用提供了实验基础，但采用超声提取仙鹤草中有效成分的工艺还未见报道。超声波具有强大的传质作用和空化作用，使溶剂分子迅速渗透到组织细胞中，与溶质充分接触，可以显著提高有效成分的提取率，广泛用于多酚等化合物的提取过程中［7，8］。本文在单因素预试验的基础上，采用响应面设计方法优化仙鹤草总多酚超声提取工艺参数，为更好地开发该传统中药提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仙鹤草购自江苏镇江九泰医药有限公司，干燥、粉碎过16目筛备用。

试验试剂:没食子酸，Folin-Ciocaltean试剂购自Sigma公司，药用乙醇购自国药集团。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);DHG-9145鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);KQ-250DB型超声波仪(昆明市超声仪器有限公司);BS 110 S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精密称取没食子酸对照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇适量溶解，定容至刻度，摇匀，取上述溶液2.5 mL定容至25 mL溶液即得100 μg·mL-1没食子酸标准溶液。分别精密量取该标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分别加入福林酚试剂0.5 mL，振摇1 min，再加入20%碳酸钠溶液2 mL，摇匀，加溶剂至刻度，在室温放置2小时。以相应的试剂溶液为空白，按分光光度法，在750 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得Y=0.0147X-0.0017，R2=0.9994，结果表明没食子酸在浓度10～100 μg·mL-1范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

1.3.2 仙鹤草总多酚的提取及含量测定

准确称取1.000 g仙鹤草粉末，加入一定体积分数的乙醇溶液20 mL，在一定温度超声提取规定时间，离心后按照标准曲线项下测定样品吸光度，计算多酚得率。

2 结果与分析

2.1 响应面实验设计

2.1.1 响应面试验安排及试验结果

根据中心组合设计原理，结合响应面分析方法，综合单因素预试验结果，固定提取时间20 min，以料液比、乙醇浓度、超声温度三个因素为自变量，总多酚的提取得率为响应值，设计3因素3水平共17个实验点的响应面分析实验。对提取温度、料液比、乙醇浓度作如下变化:X1=(x1–50)/10，X2=(x2–20)/50，X3=(x3–60)/20，因素水平分析选取见表1。实验方案与结果见表2，其中12个为析因实验，5个为中心实验。

表1 响应面因素水平编码表Table 1 Factors and levels of RSM test

料液比S o l i d -l i q u i d r a t i o ( g / m L ) x 2 1∶1 5 1∶2 0 1∶2 5乙醇浓度C o n c e n t r a t i o n ( % ) x 3 4 0 6 0 8 0

表2 响应面分析试验结果Table 2 Design and results of RSM test

2.1.2 建立模型方程与显著性检验

应用Design-Expert 7.1.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到超声温度(X1)、料液比(X2)、乙醇浓度(X3)与仙鹤草总多酚之间的二次多项回归方程:

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

表3 仙鹤草总多酚提取率方差分析结果Table 3 AVONA of total polyphenols extraction rate of Agrimonia pilosa Ledeb.

＊＊＊P＜0.001，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

由表3回归方差显著性检验表明，一次项超声提取时间、温度对总多酚得率的线性效应极显著，乙醇浓度对多酚得率的线性效应显著;二次项料液比、乙醇浓度对总多酚提取率的曲面效应极显著;比较各因子间交互作用不显著。在本实验设计范围内回归方程显著性检测P=0.0001，极显著，模型的确定系数为0.9809，说明该模型能解释98.09%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差小，证明应用响应曲面法优化的提取工艺提取仙鹤草总多酚是可行的。

2.1.3 响应曲面分析

图1 超声温度和料液比对总多酚提取得率影响的等高线和响应面图Fig.1 Response surface plots and contour plots of multual-influence of extraction temperature and material-liquid ratio on extraction rate

根据回归方程，做出响应面和等高线，考察拟合响应面的形状，分析超声温度、料液比和乙醇浓度对仙鹤草总多酚提取率的影响，如图1～3所示。等高线的形状可反应交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图1～3中可以看出，各因素间的交互作用不显著。从等高线图可以看出极值条件应在圆心处，三因素对仙鹤草总多酚的提取都有显著的影响，超声提取温度的影响最为显著，随温度提高，总多酚得率随之增大，表现为等高线更为陡峭;料液比和和乙醇浓度次之，表现为等高线曲线较平滑。

2.1.4 提取工艺条件的确定

为验证仙鹤草总多酚超声提取模型方程的适用性，对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即三个主要因素的最佳水平值，分别为: X1=1、X2=0.81、X3=0.55，转换后得到提取的最佳条件为:71%乙醇，料液比1∶24，超声提取温度60℃，提取时间20 min，预测仙鹤草总多酚得率为3.61%。按照最佳试验条件重复试验3次，计算多酚得率，求其平均值为3.56%，实际与预测的多酚得率较为接近，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面分析方法适用于仙鹤草总多酚的超声提取工艺的优化。

3 结论

采用响应面分析法对超声辅助提取仙鹤草总多酚的工艺条件进行优化，获得最佳提取工艺条件: 71%乙醇，料液比1∶24，超声提取温度60℃，提取时间 20 min，在此条件下仙鹤草总多酚得率为3.56%。超声提取方法简单，具有提取效率高、时间短、无需加热等优点，是一种较理想的提取仙鹤草多酚的方法。

1 Balasundram N，Sundram K，Samman S.Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products:antioxidant activity，occurrence，and potential uses.Food Chem，2006，99:191-203.

2 Pan Y(潘娅)，Liu HX(刘红霞)，Zhuang YL(庄玉磊)，et al.Studies on isolation and identification of flavonoids in herbs of Agrimonia pilosa Ledeb.China J Chin Mater Med (中国中药杂志)，2008，33:2925-2928.

3 Chun HH，Xiao WJ，Ying MP，et al.Antioxidant activity of alcoholic extract of Agrimonia pilosa Ledeb.Med Chem Res，2010，19:448-461.

4 Taira J，Nanbu H，Ueda K.Nitric oxide-scavenging compounds in Agrimonia pilosa Ledeb.on LPS-induced RAW264.7 macrophages.Food Chem，2009，115:1221-1227.

5 Chen YS(陈永生)，Zhang K(张焜)，Wang X(王希).Optimization of extract technology of favonoids inagrimony by orthogonal design test.Anhui Med Pharm J(安徽医药)，14: 1389-1390.

6 Zhao LF(赵立芳)，Zhang XL(张新利).Extracting tannin from Herba Agrimoniae.J Baoji Coll Arts Sci(宝鸡文理学院学报)，2000，20:196-197.

7 Ma YQ，Chen JC，Liu DH.Simultaneous extraction of phenolic compounds of citrus peel extracts:Effect of ultrasound.Ultrason Sonochem，2009，16:57-62.

8 Wang J，Sun BG，Cao YP.Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran.Food Chem，2008，106:804-810.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Polyphenols from Agrimonia pilosa Ledeb.by Response Surface Methodology

XU Xiu-quan1*，LI Feng2，TANG Jian1，XU Yuan11College of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;2Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China

Response surface methodology(RSM)was used to optimize ultrasonic-assisted extraction for total polyphenols from Agrimonia pilosa Ledeb.based on single-factor experiment.The main factors extraction temperature，liquid-material ratio and ethanol concentration were determined.The relationship between influencing factors and response values was established.The optimum extraction conditions were as follows:the extracting solvent was 71%ethanol，solid-liquid ratio was 1∶24，extracting temperature was 60℃，and extracting time was 20 min.Under these conditions，the maximal yield of total polyphenols reached 3.56%，which was well matched with the predicted content.

Agrimonia pilosa Ledeb.;total polyphenols;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

1001-6880(2012)01-0114-04

2011-03-18 接受日期:2011-06-24

镇江市社会发展项目(SH2010033)

*通讯作者 Tel:86-511-85038403;E-mail:xxq781026@sohu.com

R284.2

A