罗氏乳杆菌无细胞上清培养液移除胆固醇能力的研究

于瑞莉，郭本恒，*，张 灏，吴正钧，王荫榆

1江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122; 2光明乳业股份有限公司技术中心乳业生物技术国家重点实验室，上海200436

罗氏乳杆菌无细胞上清培养液移除胆固醇能力的研究

于瑞莉1，郭本恒1，2*，张 灏1，吴正钧2，王荫榆2

1江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122;2光明乳业股份有限公司技术中心乳业生物技术国家重点实验室，上海200436

本文探讨了罗氏乳杆菌DSM122460无细胞上清培养液(Cell-Free Supernatant，CFS)移除胆固醇的能力。采用邻苯二甲醛法测定DSM122460和对照菌株ST-III发酵过程中及其CFS对胆固醇的移除能力，并研究不同CFS浓度下的移除能力。并采用HPLC法测定CFS对照、热处理组和pH7.0组的胆盐水解酶活力，同时测定其移除胆固醇能力。结果显示，DSM122460不仅在发酵过程中具有较高的移除胆固醇能力，其CFS也表现出较高的移除能力，CFS中含有除胆盐水解酶以外的可移除胆固醇的蛋白类成分。这提示可能存在一种乳酸菌移除胆固醇的新机制。

罗氏乳杆菌;CFS;移除胆固醇;BSH;HPLC

人体血清中胆固醇含量过高容易引发高血压，冠心病等心脑血管疾病。国内外的研究表明，乳酸菌具有较强的移除胆固醇作用。虽然有大量研究发现乳酸菌在体内外具有移除胆固醇的益生功能，但作用机理尚未定论，只是提出几种假说:(1)以Gilliland［1］为代表的同化理论者认为乳酸菌细胞直接吸收胆固醇的同化作用;(2)Klaver和Vander Meer认为乳酸菌产生胆盐水解酶(Bile salt hydrolyase， BSH)将结合胆盐分解为游离胆盐，在酸性(pH＜6.0)条件下游离胆盐溶解度降低而与胆固醇发生共同沉淀作用［2］;(3)其他机理。

Taranto［3］认为罗氏乳杆菌具有较强的移除胆固醇能力，并进行了深入研究。Younghoon Kim［4］发现嗜酸乳杆菌的CFS有较好的移除胆固醇能力。本文从CFS的角度研究了罗氏乳杆菌移除胆固醇能力，发现它在无菌体参与和BSH失活的条件下仍有移除胆固醇的能力，这表明罗氏乳杆菌CFS中可能含有移除胆固醇的新有效成分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源、化学试剂与培养基

菌株来源:罗氏乳杆菌DSM122460(台湾大学赠送)和植物乳杆菌ST-III(光明乳业技术中心保藏)。菌株使用前按1%的接种量接种到MRS肉汤，在37℃培养12 h，传代两次进行活化，实验菌株在实验过程中4℃冰箱保存。

邻苯二甲醛、牛磺胆酸钠购自Sigma公司，胆固醇、卵磷脂等其他试剂为国产常规生化纯和分析纯试剂。

MRS培养基:购自德国Merck公司。

MRS-THIO液体培养基:在MRS液体培养基中加入0.2%巯基乙酸钠(THIO)。

胆固醇培养基:MRS-THIO培养基加入一定浓度的胆固醇源。

1.1.2 仪器设备

Avanti J30I高速冷冻离心机:Beckman Coulter公司;EmusiFlxe-C3高压细胞破碎仪:加拿大AVESTIN(奥威斯汀)公司;PHS-25型PH计:奥立龙公司;CE7250型紫外分光光度计:BIO-AQUARIUS公司;Waters 600高相液相色谱:美国Waters公司; JY92-III超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司;Heidolph2旋转蒸发器:德国Heidolph公司。

1.2 实验方法

1.2.1 卵磷脂-胆固醇胶束的制备

根据Razin［5］等提供的方法制备胆固醇胶束，胆固醇胶束作为胆固醇培养基中的胆固醇源。具体的方法如下:准确称取22 mg卵磷脂和10 mg胆固醇(卵磷脂和胆固醇摩尔比为1.0∶0.9)于具塞试管，加入CHCl3溶剂2 mL，超声波振荡溶解。N2流吹干溶剂，加入10 mL无菌水。试管放入冰浴，通N2条件下超声波(130 W，20 kHz)处理15 min，停止5 min保持温度平衡，循环三次;所得的溶液于4℃，38，000×g离心20 min，所得的上清液即为卵磷脂－胆固醇胶束溶液。经0.45 μm膜过滤作为胆固醇源待用，4℃保存，2～3 d内使用，作为胆固醇源用于以下的实验。

1.2.2 胆固醇的测定

按照改良邻苯二甲醛法［6］测定胆固醇浓度:准确吸取0.5 mL待测胆固醇溶液于具塞试管，加入1.5 mL 95%的乙醇溶液剧烈混匀，加入1 mL 50%的KOH溶液剧烈混匀，60℃水浴皂化10 min，不时振荡试管。冷却至室温，加入2.5 mL正己烷剧烈混匀，加入1.5 mL无菌水剧烈混匀，静置10 min分层。准确吸取正己烷层1 mL于另一洁净试管，60℃ N2流吹干溶剂，加入2 mL 0.01 mg/mL邻苯二甲醛(冰醋酸)溶液剧烈混匀，室温放置10 min，边振荡边加入2 mL浓H2SO4充分混匀。冷却至室温，550 nm处测定吸光度。根据胆固醇标准曲线［7］计算出胆固醇的含量。

1.2.3 菌体发酵过程中对胆固醇的移除作用

将种子液1%接种于含0.2%牛磺胆酸钠的胆固醇培养基中，放置于37℃恒温培养箱培养24 h，发酵液经12000 g，4℃，离心10 min得到上清液。未接种的含0.2%牛磺胆酸钠的胆固醇培养基做阳性对照，含0.2%牛磺胆酸钠的MRS-THIO培养基作为空白对照。按照方法1.2.2测定未接种培养基和上清液的胆固醇浓度，根据胆固醇标准曲线计算出胆固醇含量，胆固醇移除率的计算公式为:

1.2.4 CFS移除胆固醇能力［4］

菌株DSM122460在MRS培养基中37℃培养24 h后，12000 g，4℃ 离心10 min，收集上清液，0.45 μm膜过滤后即得到CFS，–80℃保存待用。发酵液离心后的菌体沉淀用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，用发酵液1/10体积的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀制成悬浮液，经超高压细胞破碎仪破碎细胞，离心后收集细胞裂解物，0.45 μm膜过滤后，–80℃保存备用。将胆固醇胶束、THIO和牛磺胆酸钠加入到CFS或细胞裂解物中，使其终浓度分别为100 μg/mL、0.2%(w/v)和0.2%(w/v)。然后置于37℃恒温培养箱，保温18 h，反应前对照组置于–80℃冰箱暂存，邻苯二甲醛法测反应前后胆固醇浓度。CFS移除胆固醇能力通过反应前后胆固醇的移除率体现。

为了研究CFS不同浓度的移除胆固醇能力，用新鲜MRS培养基将CFS稀释为原有浓度的75%，50%，25%。

1.2.5 BSH对胆固醇移除作用的影响

BSH的活力通过HPLC法测定反应液中牛磺胆酸钠(Sodium taurocholate，TC)的减少量。

将充分恢复活力的供试菌株，按1%接种量接种于MRS培养基中，37℃恒温培养箱培养24 h， 10000 g，4℃离心10 min，上清液经过无菌过滤后，CFS分成A、B、C三份，测其pH值。其中，A先经过90℃，15 min热处理，然后A、B、C上清培养液液按照上清培养液∶甲醇=2∶1的比例缓慢加入预冷的甲醇，4℃放置1 h，10000 g，4℃离心10 min。A、B用2 mL NaAc-EDTA缓冲液(1 mM EDTA，50 mM醋酸钠)溶解沉淀，缓冲液pH值和上清液pH相同，C用2 mL pH为7.0的缓冲液溶解，考马斯亮蓝法测其蛋白浓度。

酶反应:将A、B、C配成蛋白浓度相同的粗酶液，取粗酶液500 μL加入到含有0.04 mol/L牛黄胆酸钠的螺口管中，37℃水浴30 min，反应结束后加入500 μL流动相终止反应，缓冲液做空白对照。

HPLC色谱条件:Waters Delta 600 HPLC系统，高压二元泵、PDA检测器、在线脱气机;Nova-PakC18 (4 μm，3.9 mm×150 mm)，检测波长205 nm，进样量为 15 μL。峰面积计算用 Millennium SoftwareV3.2，牛磺胆酸的流速1.0 mL/min，所用有机溶剂均为色谱纯。

流动相A:1000 mL甲醇和1.2 mL冰乙酸混合用5 mol/L的NaOH调其pH值为5.6，流动相B: 1000 mL去离子水和1.2 mL冰乙酸混合用5 mol/L的NaOH调其pH值为5.6，通过0.45 μm聚丙烯过滤器抽滤。

1.2.6 CFS中有效成分的初步鉴定

为了探究CFS中发挥移除胆固醇作用的物质，通过乙醇抽提多糖，乙酸乙酯萃取脂类和硫酸铵沉淀蛋白的办法进行初步鉴定。在此基础上，用12%三氯乙酸和0.5%十二烷基硫酸钠(dodecyl sulfate，sodium salt，SDS)处理CFS进一步研究有效成分的性质。

乙醇抽提多糖方法如下:向CFS中加入95%乙醇，使其终体积为75%，4℃静置过夜，9000 rpm离心10 min，弃去上清，蒸馏水溶解沉淀，置于–20℃保存待用。

乙酸乙酯抽提步骤:按照CFS与乙酸乙酯为3: 1的关系向CFS中加入乙酸乙酯，倒入分液漏斗中，充分混匀，静置待分层，萃取三次。收集上层液体，旋转蒸发掉乙酸乙酯后，蒸馏水溶解剩余物质，置于–20℃保存待用。

向CFS中加入硫酸铵使其饱和度为60%，4℃静置过夜后，12000 g离心10 min，沉淀用蒸馏水溶解后4℃透析两天。

CFS中加入三氯乙酸和 SDS使其终含量为12%和0.5%，4℃静置12 h，离心，弃去沉淀，上清液4℃透析两天。

1.3 数据统计与分析

文中数据为三次平行测定值的平均值，经oneway ANOVA分析，以±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，Origin软件(Origin 7.5，美国Origin Lab公司)进行数据绘图。

2 结果

2.1 菌体发酵过程、CFS和细胞裂解物移除胆固醇能力的比较

罗氏乳杆菌和植物乳杆菌都是目前具有较高移除胆固醇能力的乳酸菌。其中ST-III的移除胆固醇的机理认为主要是同化作用和沉淀作用共同起作用，同化作用占主要作用［8］。如图1所示，同样在菌体发酵过程中具有较高降低胆固醇能力的乳酸菌，ST-III只在发酵过程时表现出较高的胆固醇移除能力，移除率为67.6%，其CFS移除胆固醇能力相对较弱，只有9.14%。而DSM122460除了在菌体发酵过程中具有很高的胆固醇移除能力，在无细胞存在时的CFS中也有较高的胆固醇移除能力，移除率为68.57%。另外，对DSM122460和ST-III进行细胞破碎后得到的细胞裂解物按照方法1.2.4测定移除胆固醇能力，发现两者的细胞裂解物基本上不表现移除胆固醇的能力。

图1 L.reuteri DSM122460和L.plantarum ST-III的生长细胞、CFS和细胞裂解物在含有0.2%的牛磺胆酸钠的胆固醇培养基中移除胆固醇能力比较Fig.1 Cholesterol removal by Growth(black bars)，the Cell-Free Supernatant(CFS，grey bars)and cell extract(pattern bars)in an MRS-THIO Broth Supplemented with 0.2%Sodium Taurocholate，plus cholesterol Micells of L.reuteri DSM122460 and L.plantarum ST-Ⅲ

用新鲜MRS液体培养基对CFS进行梯度稀释，按照方法2.1.4保温。结果显示CFS的胆固醇移除能力随着浓度的减少而降低，如图1所示。

图2 L.reuteri DSM122460不同浓度CFS对移除胆固醇能力的影响Fig.2 The effects on Cholesterol Removal by CFS of L.reuteri DSM122460 at different concentrations

2.2 BSH对移除胆固醇能力的影响

自从发现乳酸菌在肠道中可使结合胆盐分解为游离胆盐以来，BSH被认为在乳酸菌移除胆固醇方面起着关键作用。BSH将结合胆盐水解为游离胆盐后，游离胆盐需要在酸性条件下(pH＜6.0)才能和胆固醇发生共沉淀作用，从而起到移除胆固醇的能力。M.P.Taranto［4］报道罗氏乳杆菌BSH为胞内酶，相对分子量为80 KDa，最适pH为5.2，最适温度为42℃。本文为了研究BSH对罗氏乳杆菌的CFS移除胆固醇能力的影响，将CFS经过加热处理(90℃、15 min)和调节体系pH值(pH7.0)，再观察其移除胆固醇能力的变化，从而推断BSH对Lb.reuteri DSM122460 CFS移除胆固醇能力的影响。

DSM122460发酵后CFS的pH值为4.4，CFS经过甲醇沉淀提取粗酶液，粗酶液经缓冲液溶解与TC反应后用HPLC分析残余TC的含量，结果如表1所示，TC标准品的出峰时间在6.7 min左右出峰，样品组中6.7 min左右出的峰是TC组分。

表1 牛磺胆酸钠含量检测结果Table 1 The result of the detected sodium taurocholate

图3 经过热处理、pH处理和未处理CFS的BSH活力和移除胆固醇能力比较Fig.3 Effects of Heat，pH Treatment and CFS control on the Cholesterol Reduction(black bars)and BSH Activities (grey bars)of a Cell-Free Supernatant(CFS)

CFS对照组和经过处理的CFS其BSH活力和移除胆固醇能力的比较如图3所示，CFS对照组同时具有较强移除胆固醇能力和强度相当的BSH活力。将pH调为7.0后，CFS具有较低的BSH活力，此时虽然还有BSH活性，但是因为只有在酸性条件下，游离胆盐才能和胆固醇共同沉淀下来，理论上来讲pH7.0时通过共沉淀作用移除胆固醇的能力应该比较低，但是图3中显示pH7.0时移除胆固醇的能力仍能保持在CFS对照组的70%左右;而经过热处理(90℃、15 min)的CFS尽管残留了较低BSH活力，但其胆固醇移除能力几乎丧失殆尽。

2.3 CFS有效成分的初步鉴定

CFS乙醇抽提物有20%的移除胆固醇能力，乙酸乙酯萃取物只有百分之几的移除能力，硫酸铵沉淀后有45%的移除能力。另外，CFS经过12%三氯乙酸或0.5%SDS除去蛋白后，基本上没有移除胆固醇能力。

3 讨论

本实验从CFS的角度研究罗氏乳杆菌移除胆固醇的能力。实验结果发现罗氏乳杆菌DSM122460和植物乳杆菌ST-III在发酵过程都具有较好的移除胆固醇能力，但是就对CFS而言，罗氏乳杆菌DSM122460的移除胆固醇能力要明显强于ST-III，可达到68.57%左右。进一步对CFS进行梯度稀释后，结果表明CFS的移除胆固醇能力随浓度的降低而降低，证明CFS中含有可移除胆固醇的有效成分。

但是罗氏乳杆菌中的BSH在体外移除胆固醇的过程中起着非常重要的作用，所以必须排除CFS中BSH的影响。经过热处理可使BSH失去活力，将CFS调pH为7.0时由其起作用的游离胆酸和胆固醇的沉淀作用不容易发生，也可以排除BSH的影响。结果显示经过热处理的CFS具有较低的BSH活性和移除胆固醇能力，pH为7.0的CFS在具有较低BSH活性的情况下仍然具有较高的移除胆固醇能力，可以表明CFS中除了BSH以外还有可以移除胆固醇的有效成分。CFS经过盐析后的蛋白沉淀有较高的移除胆固醇能力，但经过SDS和三氯乙酸除蛋白后，基本没有移除胆固醇的能力，既可证明CFS中此有效成分为蛋白质类。

后续工作将致力于研究此有效成分的分离，进一步纯化并提取出该物质，并分析其移除胆固醇的作用机理。

1 Gilliland SE，Nelson CR，Maxwell C.Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus.Appl Environ Microbiol，1985，49:377-381.

2 Klaver FR，Vander Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidbacterium bifidum is due to their bile salt deconjugating activity.Appl Environ Microbiol，1993，59:1120-1124.

3 Taranto MP，Sesma F，De Valdez GF.Bile salt hydrolase plays a key role on cholesterol removal by Lactobacillus reuteri.Biotechnol Lett，1997，19:845-847.

4 Kim Y，Whang JY，Whang KY，et al.Characterization of the cholesterol-reducing activity in a cell-free supernatant of Lactobacillus acidophilus ATCC 43121.Biosci Biotechnol Biochem，2008，72:1483-1490.

5 Razin S，Kutner S，Efrati H，et al.Phospholipid and cholesterol uptake by mycoplasma cells and membranes.Biochim Biophys Acta，1980，598:628-640.

6 Rudel LL，Morris MD.Determination of cholesterol using οphthalaldehyde.J Lipid Res，1973，14:364-366.

7 Gilliland SE，Walker DK.Factors to consider when selecting a culture of lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans.J Dairy Sci，1990，3:905-911.

8 Liu J(刘娟)，Wang YY(王荫榆)，Wu ZJ(吴正钧)，et al.Study on mechanism of cholesterol removal by Lactobacillus plantarum ST-III Strain.Ind Microbiol(工业微生物)，2008，38(5):71-91.

Cholesterol-Reducing Activity in a Cell-Free Supernatant of Lactobacillus reuteri

YU Rui-li1，GUO Ben-heng1，2*，ZHANG Hao1，WU Zheng-jun2，WANG Yin-yu21State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy and Food Co.Ltd.，shanghai 200436，China

The cholesterol removal ability of cell-free supernatant(CFS)produced by growth of Lactobacillus reuteri DSM122460 in MRS broth was investigated.The cholesterol removal ability of L.reuteri train DSM122460 as well as L.plantarum strain ST-III during growth in MRS and the resulted CFS was assayed by o-phthalaldehyde method，respectively.In order to elucite the correlation between BSH activity and the cholesterol removal ability of the Lactobacillus strains，BSH roles in cholesterol removal were measured by heat treatment and pH adjustment.The remaining BSH activities after various treatments were measured by HPLC.The results showed that L.reuteri strain DSM122460 not only had a high ability to remove cholesterol during its growth in MRS broth，it aslo demonstrated high cholesterol reduction activity in the CFS.Beside the BSH，it was speculated there may be another effective component in the CFS with the ability to remove cholesterol.It suggested that there might be a new mechanism underlying cholesterol reduction by lactic acid bacteria.

Lactobacillus reuteri;CFS;cholesterol reduction;BSH;HPLC

1001-6880(2012)01-0089-05

2010-09-28 接受日期:2011-02-28

上海市科技委员会乳业生物工程技术研究中心(09DZ2251400);上海市科技委员会乳业生物技术国家重点实验室筹建(10dz2221100)

*通讯作者 E-mail:guobenheng@brightdairy.com

TS201.3

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