外源咖啡酸和阿魏酸对黑莓汁中花色苷的辅色研究

彭常安，卢锋波，袁 晔，唐小媛，韩永斌*

1芜湖职业技术学院生物工程系，芜湖241006; 2南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放试验室，南京210095

外源咖啡酸和阿魏酸对黑莓汁中花色苷的辅色研究

彭常安1，卢锋波2，袁 晔2，唐小媛2，韩永斌2*

1芜湖职业技术学院生物工程系，芜湖241006;2南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放试验室，南京210095

为增强黑莓汁中花色苷的稳定，添加适量咖啡酸和阿魏酸到黑莓清汁中，采用可见吸收光谱和高效液相色谱-质谱研究其对黑莓花色苷的辅色作用。研究结果表明:黑莓汁中添加咖啡酸和阿魏酸显著增加了花色苷的最大吸收值(Aλmax)，最大吸收波长(λmax)红移，说明咖啡酸和阿魏酸对黑莓汁中花色苷产生了辅色作用，辅色效应随时间的延长和咖啡酸、阿魏酸浓度的增加显著增强。HPLC-DAD-MS分析发现，咖啡酸辅色产生了两种新的花色苷衍生物(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚和矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚)，阿魏酸辅色产生了三种新的花色苷衍生物(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚、矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚和矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷-4-乙烯基愈创木酚)，这些衍生物均为羟苯基-吡喃花色苷。

黑莓汁;花色苷;咖啡酸;阿魏酸;辅色

辅色作用作为改善富含花色苷食品颜色稳定性的有效手段［1，2］，近年来已成为研究热点。阿魏酸、香豆酸、芥子酸等酚酸类成分是重要的辅色素，在富含花色苷的植物中，通过酯键与花色苷酰基化后存在于液泡中［3-5］。在红葡萄酒陈酿过程中这些酚酸成分与花色苷反应形成乙烯基吡喃花色苷，而非酰化花色苷，有效防止了水分子对花色苷母核的亲核攻击，从而提高花色苷的稳定性［6］;Gris等［7］的研究表明赤霞珠葡萄提取物中花色苷的稳定性受温度、光线和pH值等的影响，但咖啡酸辅色可使其稳定性增加。

黑莓(Rubus spp.)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus L.)植物，花色苷含量较高，主要有矢车菊-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-O-丙二酸酰葡萄糖苷和矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷等，其中矢车菊-3-O-葡萄糖苷含量高达70%以上［8，9］。虽然黑莓中酚酸类含量较丰富［10，11］，但黑莓及其加工品的色泽却很不稳定，在加工和贮藏过程中极易变色。本文首次研究了添加咖啡酸和阿魏酸对黑莓汁中花色苷的辅色作用，并采用HPLCDAD-MS鉴定了辅色所产生的花色苷衍生物。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

黑莓(Rubus spp.)冻果:江苏新得利食品有限公司;咖啡酸和阿魏酸(色谱纯):Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂);UV-2803紫外可见分分光光度计(美国尤尼克公司); pH计(Thermo Orion 868，Orion，USA);Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent，USA)。

1.2 黑莓清汁的制备

黑莓冻果经4℃隔夜解冻，榨汁机中打浆，2810 ×g离心15 min，上清液再经14800×g离心15 min得到澄清黑莓汁，于–16℃冻藏备用。

1.3 咖啡酸和阿魏酸的辅色

用无水乙醇配制浓度为10 mg/mL的咖啡酸和阿魏酸溶液，分别吸取100 μL和200 μL上述辅色剂溶液、2 mL黑莓汁，用pH 3.2的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液定容至10 mL，得到最大吸收值(Aλmax)为0.9、酒精度在1～2°、咖啡酸和阿魏酸浓度为100或200 mg/L的黑莓汁。将该溶液于85℃灭菌15 min后，迅速冰水冷却，于4℃避光放置30天，16℃放置30天后4℃放置。

1.4 花色苷及其衍生物HPLC-DAD-MS分析

采用Agilent SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)柱进行HPLC分析，温度35℃，流速为0.6 mL/min，200～600 nm全扫描。洗脱液为乙腈(B)和0.5%甲酸(A)(v:v)，洗脱梯度为0～10 min，10%～25%B; 10～25 min，25% ～30%B。电喷雾质谱毛细管温度195℃电压4 kV，分别以正负离子两种模式，雾化压力为2.33×105Pa，氮气流速分别为6和1.2 mL/min。

1.5 统计与分析

采实验设3次重复，结果取平均值，用SAS 9.1.3软件进行多重比较分析(显著性水平为0.05)。

2 结果与讨论

2.1 咖啡酸与花色苷的辅色

2.1.1 可见吸收光谱的变化

辅色剂对花色苷的辅色效应通常表现为对花色苷的可见吸收光谱图的影响，即最大吸收波长的移动(△λmax)和颜色增强效应-最大吸收值的增加(△Aλmax)［12］。由图1可知，在黑莓汁体系下，咖啡酸的添加对花色苷的可见吸收光谱产生了显著影响。与对照组相比，60 d时，添加咖啡酸100 mg/L、200 mg/L的花色苷溶液λmax分别右移了3 nm和5 nm，Aλmax分别增加了10.81%和58.38%;这表明咖啡酸与花色苷发生了分子间辅色作用，辅色效应随咖啡酸浓度的增加显著增强(P＜0.05);100 d后，咖啡酸处理组的Aλmax分别增加了33.34% 和 94.53%，辅色组间Aλmax差异显著(P＜0.05)。可见，在黑莓汁体系下，咖啡酸的辅色作用随咖啡酸浓度的增加而增强。

2.1.2 花色苷组成的变化

由图2可知，咖啡酸辅色后对花色苷组成产生了影响。100 d时，辅色组中检测到了大量的两种花色苷衍生物:峰1'和峰2'。

2.2 阿魏酸与花色苷的辅色

2.2.1 可见吸收光谱的变化

由图3可知，在黑莓汁体系下，阿魏酸的添加对花色苷的可见吸收光谱产生了显著影响。与对照组相比，60 d时，咖啡酸处理组λmax分别右移5 nm和6 nm、Aλmax分别增加了32.43%和45.95%，表明阿魏酸与花色苷发生了较强的分子间辅色作用，辅色作用随阿魏酸浓度的增加而增强(P＜0.05);辅色100 d后，辅色组Aλmax分别增加了72.75%和106.52%，辅色组间差异显著(P＜0.05)。可见，在黑莓汁体系下，阿魏酸与花色苷的辅色反应较为缓慢，在60 d时辅色已明显发生，60～100 d时，辅色反应仍在继续，辅色强度随阿魏酸浓度的增加而增强。

2.2.2 花色苷组成的变化

阿魏酸辅色后花色苷组成发生了变化(图4)，100 d时，辅色组中检测到了大量的三种花色苷衍生物:峰1''、峰2''和峰3''。

2.3 花色苷衍生物结构解析

据王卫东等报道［13］，黑莓花色苷各组分分别为矢车菊-3-O-葡萄糖苷(［M］+为m/z 449)、矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷(［M］+为m/z 419)、矢车菊-3-O-丙二酸酰葡萄糖苷(［M］+为m/z 535)和矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷(［M］+为 m/z 593)。采用HPLC-PDA-MS技术对辅色后花色苷衍生物进行分析，经咖啡酸辅色后的花色苷衍生物主要有两种，其分子量如表1所示，峰1'(［M］+为m/z 581)和峰2' (［M］+为m/z 725)分子量符合:MWC(咖啡酸辅色的花色苷衍生物分子量)=MWA(某花色苷分子量) +MWB(咖啡酸分子量180)-(44+1×4);同时，Rentzscha等［6］研究认为酚酸(阿魏酸、咖啡酸等)可在花色苷的C-4和C-5位发生加成反应形成吡喃型花色苷。据此可推测峰1'和峰2'分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷与咖啡酸在C-4和C-5位发生加成反应后形成的花色苷衍生物(图5)。

表1 咖啡酸或阿魏酸辅色后的黑莓花色苷衍生物Table 1 Backberry anthocyanins derivatives co-pigmented with caffeic acid or ferulic acid

经阿魏酸辅色后的花色苷衍生物主要有三种，其分子量如表1所示，峰1''(［M］+为m/z 595)、峰2''(［M］+为m/z 739)和峰3''(［M］+为m/z 565)，分子量符合:MWC(阿魏酸辅色的花色苷衍生物分子量)=MWA(某花色苷分子量)+MWB(阿魏酸分子量194)-(44+1×4)。据此可推测峰1''、峰2''和峰3''分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷和矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷和阿魏酸在C-4和C-5位发生加成反应后形成的花色苷衍生物(图5)。

图5 咖啡酸或阿魏酸辅色形成的花色苷衍生物结构式Fig.5 Structures of blackberry anthocyanin derivatives co-pigmented with caffeic acid or ferulic acid

综上，黑莓汁中咖啡酸和阿魏酸对花色苷产生了辅色作用，显著增加了花色苷的最大吸收值;咖啡酸辅色和阿魏酸辅色分别产生了两种和三种花色苷衍生物;其中，咖啡酸辅色产生的花色苷衍生物为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚加成物和矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚加成物;阿魏酸产生的花色苷衍生物为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚加成物、矢车菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚加成物和矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷-4-乙烯基愈创木酚加成物。黑莓汁中花色苷易发生降解，导致黑莓汁颜色变为暗红。以上试验结果表明，添加适量咖啡酸和阿魏酸的能提高花色苷的稳定性，从而较大程度地保持黑莓汁的颜色和营养成分。

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Copigmentation Effects of Exogenous Caffeic Acid and Ferulic Acid on Anthocyanins in Blackberry Juice

PENG Chang-an1，LU Feng-bo2，YUAN Ye2，TANG Xiao-yuan2，HAN Yong-bin2*1Bioengineering Department Wuhu Vocational＆Technical College，Wuhu 241006，China;2Key Laboratory of Food Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

To enhance the stability of anthocyanins in blackberry juice，the co-pigmentation effects of exogenous caffeic acid and ferulic acid on anthocyanins in blackberry juice were investigated using visible absorption spectra and HPLCDAD-MS.The results showed that both caffeic acid and ferulic acid could significantly increase the absorption intensity (Aλmax)and its wavelength(λmax)of anthocyanins in blackberry juice.These phenomena suggested occurrence of copigmentation effects of caffeic acid and ferulic acid on anthocyanins in blackberry juice.The co-pigmentation intensity depended on duration and concentrations of caffeic acid and ferulic acid.Two new anthocyanin derivatives(cyanidin-3-glucoside-4-vinylcatechol and cyanidin-3-dioxalylglucoside-4-vinylcatechol)and three new anthocyanin derivatives(cyanidin-3-glucoside-4-vinylguaiacol，cyanidin-3-dioxalylglucoside-4-vinylguaiacol and cyanidin-3-glucoside-arabinoside-4-vinylguaiacol)were observed in blackberry juice with HPLC-DAD-MS analysis by adding caffeic acid and ferulic acid，respectively.

blackberry juice;anthocyanin;caffeic acid;ferulic acid;co-pigmentation

1001-6880(2012)01-0094-04

2011-01-19 接受日期:2011-06-24

江苏省自然基金项目(BK 2009649);国家科技服务企业项目(2009GJC10019);江苏高校优势学科建设工程资助项目

*通讯作者 Tel:86-25-84396293;E-mail:hanyongbin@njau.edu.cn

R284.2

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