兔精液常温保存稀释液筛选及人工授精效果的试验

张海容

（1.德州学院农学系，山东 德州253023；2.德州兔业工程技术中心，山东 德州253023）

随着兔的人工授精技术在集约化养兔场中的推广与应用，精液保存技术越来越受到重视，并日益显示出在降低养殖中的饲养成本发挥作用。虽然冷冻精液不受地域和时间的限制，家兔的精液冷冻保存研究早于其他家畜，但进展缓慢，在生产实践中没有得到广泛的应用［1－2］。从液态精液保存效果来看 ，常温保存更有利于兔的实际生产应用中［3］。为此，近年来精液常温保存方法已广泛应用于兔的人工授精技术中。目前，市场上主要从国外引入的稀释液和常用的0.9%生理盐水、5%葡萄糖和葡－柠－卵，国外进口稀释液价格较贵，对规模化兔场养殖，0.9%生理盐水、5%葡萄糖效果不佳，而葡－柠－卵稀释液要先用现配，使用不方便，针对以上情况。研究开发国内优良稀释液，对增加养兔效益，推动兔规模化养殖和人工授精技术的应用具有重要意义。本试验为研制优良稀释液而进行有益的探索。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点 2009年4月20日～2009年11月22日。山东省德州肉兔场。

1.2 试验药品和试验仪器 葡萄糖（分析纯）、Tris、柠檬酸、柠檬酸钠（分析纯）、氯化钾、碳酸氢钠、EDTA（分析纯）、青霉素、链霉素、德国进口稀释粉。

试验仪器：密度仪，电子显微镜，恒温水浴锅，双蒸馏水器，磁力搅拌器，恒温板，精密温度计。

1.3 精液样品采集 供试验用精液随机采自肉兔场健康公兔，采用采精器采集5只公兔精液混合后备用，镜检活率在0.8以上者供稀释保存使用。

1.4 稀释液配方 0.9%生理盐水、5%葡萄糖、葡－柠－卵稀释配方、自配葡－柠－EDTA、Tris－葡－柠配方和德国进口稀释液（见表1）。

表1 稀释液配方

1.5 稀释液保存效果观察

1.5.1 稀释液的配制 按配方要求准确称量稀释液各成分，并放入消毒过的干燥烧杯内，用双蒸水稀释至100mL，用玻璃棒搅拌使其充分溶解。溶解后每100mL稀释液加入青霉素、链霉素各10万IU（μg），稀释液现配现用。

1.5.2 精液的稀释及保存 精子活力在0.8以上，密度在7×108以上。对所采的精液分别用5种稀释液按1∶6～1∶10倍等温稀释，稀释精液时，将稀释液沿杯壁慢慢倒入精液中，然后将分装好的精液转存于15℃恒温箱内保存。

1.5.3 稀释液保存效果观察及指标测定 按10级评分法评定精子的活力，每6h观察评定1次，直至精子全部死亡，根据活力变化情况，计算有效存活时间（精子活力在0.5以上的保存时间）、总存活时间（精子全部失活的保存时间）、生存指数（∑［﹙上次活力＋下次活力﹚／﹙2×时间间隔﹚］。

1.6 配种试验 经产母兔采用孕马血清激素和超排3号同期诱导发情，稀释液稀释精液1～2d的保存后，对发情母兔进行输精，采用摸胎方式确定受胎率。

1.7 数据处理 数据分析用SPSS13.0统计软件中的t检验及方差分析进行数据处理。

2 试验结果与分析

2.1 精子有效存活时间和总存活时间 见表2。

表2 不同精液稀释液有效存活时间和总存活时间试验结果（h）

从表2可以得知，保存于 Tris－葡－柠、葡－柠－EDTA和德国进口稀释粉的精子的有效存活时间差异不显著（P＞0.05），较葡－柠－卵分别延长29.2 h、35.6h、32.6h，差异极显著（P＜0.01），较5%葡萄糖和0.9%生理盐水延长48.8h、55.2h、52.2h和50.3h、56.7h、53.7h，差异极显著（P＜0.01）。而精子总存活时间与精子有效存活时间有相似趋势。结果表明，从精子总存活时间与精子有效存活时间来看，Tris－葡－柠、葡－柠－EDTA和德国进口稀释液保存效果最好。

2.2 精子生存指数 由表3可知，Tris－葡－柠、葡－柠－EDTA和德国进口稀释液保存精子的生存指数差异不显著（P＞0.05），都极显著高于其他3种常用稀释液（P＜0.01）。

表3 不同精液稀释液保存精子的生存指数试验结果

2.3 稀释液保存精液输精后受胎率统计 不同稀释液保存精液输精后受胎率统计结果见表4。精子的保存时间过长，会导致精子畸形率上升，受胎率下降，葡－柠－EDTA、Tris－葡－柠和德国进口稀释液稀释液保存1d和2d内，受胎率都是最高的，而0.9%生理盐水和5%葡萄糖保存是受胎率最低。在兔场规模化养殖过程中，保存于稀释液中1～2d的精液足以满足人工授精的需求。

表4 释液保存精液输精后受胎率及产仔数统计

3 讨论

对精子有效存活时间、总存活时间、生存指数和受胎率的测定结果表明，葡－柠－EDTA、Tris－葡－柠和德国进口稀释液保存效果一致，保存精子的效果优于0.9%生理盐水、5%葡萄糖和葡－柠－卵。从价格成本上计算，德国进口稀释液＞Tris－葡－柠＞葡－柠－EDTA，而且兔场输精所用的精液保存2d以内的精液，葡－柠－EDTA精液稀释粉配好后，可在4℃～10℃温度下保存半年，使用方便。因此对规模养兔场来说，可在生产中推广使用，效果良好。

［1］袁慕陶，尹召华.兔精液的液态保存对受胎率的影响［J］.毛皮动物饲养，1989，1：5－7.

［2］Viudes－de－Castro M P，Vicente J S.A simple method for freezing rabbit semen with successful results on fertility and prolificity［J］.Animal Reproduction Science，1996，44：195－201.

［3］张嘉保，周虚.动物繁殖学［M］.长春：吉林科学技术出版社，1999.