检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体的两种ELISA方法的比较及其应用

吴雪军，周彩琴，赵灵燕，陈星宇，吴赟竑，王燕萍，张传亮，姜中其，徐 辉

（1.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州310020；2.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州310029）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS），是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的、以母猪繁殖障碍及仔猪和育肥猪呼吸道疾病为特征的急性病毒性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难。PRRS在全世界各主要养猪国家均有发生，近年来我国也有多个省份的养猪场、农户暴发疫情，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简便、易于标准化、快速敏感等优点，非常适合进行大规模流行病学调查和监测［3］。目前，针对PRRSV的不同抗原有两种检测PRRSV抗体的ELISA方法：G－ELISA方法采用膜蛋白（M 蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作为包被抗原；N－ELISA方法以核衣壳蛋白（N蛋白）作为主要包被抗原。本试验拟通过对这两种间接ELISA方法进行比较，分析其在免疫监测和临床检测中的特点，为应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 N蛋白抗体检测ELISA（N－ELISA）试剂盒由美国IDEXX公司生产（Herd－Check＊PRRS X3），批号：40959－V931；膜蛋白抗体ELISA（G－ELISA）试剂盒由法国LSI公司生产（LSI TEST SUIS PRRS），批号：5－VETPRA－004。

1.2 检测样品 根据试验设计从浙江省内的10个规模猪场采集猪血清共216份，其中仔猪70份，生长猪30份，后备种猪40份，育肥猪76份，－20℃保存备用。

1.3 检测方法及结果判定 PRRSV抗体检测方法均按照试剂盒说明书进行。N－ELISA方法以（S／N）值判定结果，其中S／N≥0.40为PRRS抗体阳性，S／N＜0.40为PRRS抗体阴性；G－ELISA 方法以IRPC值判定结果，其中IRPC≤20.0为抗体阴性，IRPC＞20.0为抗体阳性。为方便两种ELISA方法检测结果比较分析，将IRPC值标准化，即将IRPC转换成IRPC／100，与S／P值一致。

1.4 检测数据处理分析 通过计算相关系数、符合率、Kappa值等统计学和流行病学指标，综合评价试验结果。

2 结果与分析

2.1 两种检测方法结果一致性的分析 采用两种检测方法同时检测10个猪群216份血清，并按试剂盒给定的临界点来判断结果的阴阳性，具体结果见表1。

结果表明，两种ELISA方法在检测PRRS血清抗体时，阳性率差异不显著（P＞0.05），符合率达到92.6%，Kappa值为0.74，表明两种ELISA检测方法在按试剂盒提供的阴阳性临界点进行结果定性判断并统计抗体阳性率时，具有良好的一致性（表1、图1）。但是，两种检测方法所得到的PRRS抗体水平效价差异明显，相关系数也仅为0.651，见图2。

2.2 设定不同阴阳性临界点时两种检测方法的阳性率变化 以全部216份猪血清样品作为一个整体，将G－ELISA方法所得结果IRPC值转换成IRPC／100后，通过调整两种ELISA方法的阴阳性临界点比较检测相同样品时的猪群PRRS抗体阳性率的变化趋势，如图3结果所示，两种检测方法在同时调整阴阳性临界点时，总体变化趋势基本一致，应用统计学方法建立的方程分别为：y＝－1.504 9x＋86.694和y＝－4.210 3x＋84.26，斜率为－1.504 9和－4.210 3，G－ELISA方法的阳性率变化幅度更大，统计学上呈显著差异。

为进一步分析阴阳性临界点变化对两种ELISA方法阳性率检测结果的影响，以A、B、C、D四个猪群作为研究对象，调整阴阳性判定的临界点，分析在不同免疫状况下，两种检测方法所得出的阳性率变化情况，具体结果见图4、5。

由图4、图5可知，当临界点逐渐提高以后，用两种检测方法所得的阳性率逐渐降低，且对不同的免疫背景猪群阳性率变化总体趋势均没有显著的影响。但两者的下降幅度有所不同，N－ELISA检测方法对PRRS弱毒苗免疫后30d猪群阳性率明显高于G－ELISA；而PRRS弱毒苗免疫后107d猪群阳性率检测结果表明，G－ELISA的高抗体水平维持时间比N－ELISA长。

3 分析与讨论

一直以来，国内通常以N－ELISA（美国IDEXX公司生产）作为PRRSV抗体检测的“金标准”，该方法敏感、特异、快速，适合于PRRS的早期预警。但由于N蛋白不能诱导产生病毒中和抗体，应用中常被认为以N蛋白作为包被抗原的试剂无法反应机体的免疫状态，不适合用于对疫苗免疫效果监测。G－ELISA以膜蛋白（包括 M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）。其中 GP5蛋白是一种主要的结构蛋白，对于受体识别具有一定的作用。由于N端的外侧结构域含有一个主要的中和抗体决定簇，这就证实了GP5结构在病毒的侵染过程中起着一定的作用［1～3］。由于膜蛋白为PRRSV主要表面抗原，在病毒传播和机体免疫中起关键作用，因此普遍认为采用膜蛋白作为包被抗原的ELISA诊断方法不仅能检测野毒感染状况，而且能解决N蛋白作为抗原的诊断方法无法反映机体免疫状况的缺陷，有利于疫苗抗体水平的检测，为猪场进行疫苗免疫效果评估提供重要的技术手段，所以这种方法在评估疫苗的免疫效果中更为准确可靠。

研究结果表明，G－ELISA与N－ELISA两种检测方法阳性率结果差异并不显著，具有很高的符合率和一致性。因此，通过数据标准化，调整阴阳性判定的临界点，两种方法在一定程度上互相代替是可行的。由于两种方法包被的抗原不同，N－ELISA方法测出的阳性率和效价均比G－ELISA要高，这也与N蛋白在病毒粒子中表达量较高相吻合，同时这也可能造成了一定比例的假阳性。当采用N－ELISA方法做免疫效果评估时，若发现与免疫保护效果相关性差距较大时，应考虑选用G－ELISA方法，并适当调整阴阳性判定的临界点，使得与实际情况更符合。

在对阴性猪场进行PRRSV抗体监测时，可考虑采用N－ELISA方法，以便能够较早的发现病毒感染，为防疫争取更多的时间；临床稳定且用PRRS疫苗免疫的猪场建议采用N－ELISA方法，并可以通过调整阴阳性临界点，使结果更接近G－ELISA和猪群的实际情况；对于临床不稳定的猪场，应当采用G－ELISA方法进行抗体检测，以准确反应猪群的整体免疫状况，但建议对现有的阴阳性临界点进行调整，因为根据现有商品化试剂盒提供的N－ELISA和G－ELISA判定依据获得的群体抗体阳性率并未表现出显著差异，也无法以更好的体现出G－ELISA方法的特点。

［1］杜文金，刘卫，王志亮，等.应用重组猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白为抗原建立ELISA检测方法的研究［J］.中国兽医科技，2000，30（6）：7－9.

［2］Ferrin N H，Fang Y，Johnson C R，etal.Validation of a blocking enzyme－linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2004，11：503－514.

［3］Seuberlich T，Tratschin J D，Thur B，etal.Nucleocapsid proteinbased enzyme－linked immunosorbent assay for detection and differentiation of antibodies against European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9：1183－1191.