产蛋下降鸭群强毒新城疫病毒的分离鉴定与分子特征

胡北侠，王 艳，杨少华，许传田，黄艳艳，张秀美

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南250100；2.六和饲料股份有限公司动保中心，山东 青岛266109）

新城疫是严重危害我国和世界养禽业的主要病毒性传染病之一，病原是新城疫病毒（NDV）。NDV属于单股负链、不分节段RNA病毒，基因组长度约为15.2kb，包括3′－NP－P－M－F－HN－L－5′六个基因，分别编码6种主要结构蛋白［1］。NDV只有一个血清型，但是可以分为不同的基因型。最近研究发现，根据病毒基因组长度、F基因和L基因序列，NDV可分为两大分支：ClassⅠ和ClassⅡ［2］。ClassⅠNDV主要包括水禽和活禽市场分离株，而ClassⅡNDV可以分为基因Ⅰ～Ⅸ型，包括家禽、宠物鸟以及野鸟分离株［3－4］，研究表明，基因Ⅶ是我国目前NDV流行株的优势基因型。

流行病学研究证明，水禽是NDV的天然贮存宿主［3］。自1997年以来，国内不断有水禽感染NDV发病的报道［5］，似乎表明NDV的流行病学已经发生新的变化。自2008年11月至2009年2月，本实验室从发生产蛋下降的两个肉种鸭群中分离了两株NDV强毒，并对其F基因和HN基因进行了序列分析和同源性比较，进一步丰富了NDV的分子流行病学信息。

1 材料与方法

1.1 SPF鸡、鸡胚、菌种、质粒和试剂 SPF鸡、鸡胚由山东家禽所SPF鸡研究中心提供。工程菌DH5a由本实验室保存。RNA抽提试剂、DNA回收、PCR试剂盒等，均购自TaKaRa公司。

1.2 病毒分离鉴定 取病鸭气管、肝脏和输卵管等组织研磨、无菌处理后接种10～11日龄SPF胚。用ND，禽流感（H5、H9）阳性血清和NDV单抗对分离毒进行鉴定。参考文献［1］方法进行鸡胚平均死亡时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI）的测定。

1.3 引物、病毒RNA提取及RT－PCR 扩增F和HN基因的引物序列参考文献［6］。

病毒RNA的提取、反转录按试剂盒说明书进行。PCR均采用50μL反应体系，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4 目的基因的克隆与序列测定 将各PCR产物通过凝胶电泳回收各目的条带进行抽提、纯化后与pMD18－T vector进行连接、转化和蓝／白斑筛选，挑取白色菌落接种于LB培养基中扩增培养，提取其质粒，并进行PCR鉴定。经PCR鉴定为阳性的重组质粒，送北京华大基因研究中心测序。

1.5 F基因（374bp）分型与同源性比较 参考文献［3－5］等基因分型方法，利用DNAStar 7.0（MegAlign）软件对NDV分离株和参考株进行F基因分型，绘制系统进化树。分别对鸭NDV分离株和参考毒株的F基因和HN基因全长同源性进行分析比较。

2 结果

2.1 病毒分离鉴定 两份鸭病料接种SPF鸡胚后于48～84h致死鸡胚，尿囊液HA效价为28和27，HI试验中与NDV阳性血清、NDV单抗反应阳性，与AIV（H5、H9）阳性血清反应均为阴性，初步确定为 NDV，分别命名为Duck／China／SD6／2008 和Duck／China／SD7／2009，其 MDT 分别为77.6h，ICPI为2.0，符合强毒NDV的特征。

2.2 病毒F、HN基因RT－PCR和序列测定结果F、HN基因均扩增出了目的片段（图略）。经测序后，F基因开放阅读框架（ORF）全长1 662bp，编码553个氨基酸，第112～117位氨基酸序列为112－RRQKRF－117，符合强毒NDV F蛋白裂解位点的分子特征。HN基因ORF全长1716bp，编码571个氨基酸。

2.3 F基因（1－374bp）基因分型与同源性比较从图1可以看出，2个鸭NDV分离株属于NDV ClassⅡ分支，与国内近年来分离的基因ⅦNDV遗传距离较近，而与健康鸭群NDV分离株Duck／China／58／2008［7］遗传距离较远。

图1 根据NDV F基因高变区（374bp）绘制的遗传进化树

F和HN基因全长同源性分析发现，2个鸭NDV分离株与与基因ⅦNDV分离株同源性较高，分别为94.1%～99.7%和94.4%～97.1%，与同期分离的鸡源NDV强毒株Chicken／China／SD4／2008（HM748947）同源性最高，分别为99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，而与健康鸭群 NDV分离株Duck／China／58／2008（ClassⅠ分支）同源性为65.1%～65.3%和72.3%～72.6%。两个鸭分离株 Duck／China／SD6／2008和 Duck／China／SD7／2009F基因和HN基因全长同源性分别为99.8%和99.5%。

3 分析与讨论

随着临床上鸭群感染NDV发病的不断出现，山东省部分蛋鸭或种鸭群已进行ND疫苗的免疫，本研究的发病鸭群也已进行ND免疫，发生产蛋下降前NDHI抗体滴度分别为6.3log2～7.4log2和9.4log2～12log2，鸭群主要表现采食量下降，死淘率正常，产蛋下降15%～30%，畸形蛋增加。从发生产蛋下降到恢复正常一般需要2～4周，新城疫HI抗体滴度并没有明显的升高（另文报道），而鸡群感染NDV发生产蛋下降前后HI抗体滴度一般会升高2log2左右，具体原因尚有待进一步研究。

建立在NDV F基因高变区（374bp）的系统进化和基因分型方法已被证明是NDV分类的最有效方法，广泛用于NDV的分子流行病学研究。基因分型结果表明，2个鸭NDV分离株属于基因Ⅶ，与国内近年来分离的基因ⅦNDV遗传距离很近，特别是与本实验室同期分离的山东省鸡源NDV强毒株（Chicken／China／SD4／2008）遗传距离最近，而与本实验室从健康鸭群分离的ClassⅠ NDV（Duck／China／58／2008）明显不同。F基因和HN基因全长序列分析结果表明，2个鸭NDV分离株与同期鸡源NDV 分离株 Chicken／China／SD4／2008 核苷酸同源性分别为99.3%～99.5%和99.5%～99.7%，与健康鸭群NDV分离株Duck／China／58／2008同源性为65.1%～65.3%和72.3%～72.6%，表明2个鸭NDV分离株可能来源于鸡群，而与从健康鸭群分离的NDV弱毒株无关。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：743－748.

［2］Alíz Czeglédi，Dorina Ujvári，Eszter Somogyi，etal.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1（Newcastle disease virus）and evolutionary implications［J］.Virus Research，2006，120：36－48.

［3］L Mia Kim，Daniel J King，Phillip E Curry，etal.Phylogenetic Diversity among Low－Virulence Newcastle Disease Viruses from Waterfowl and Shorebirds and Comprarion of Genotype Distributions to Those of Poultry－Origin Isolates［J］.Journal of Virology，2007，12：12641－12653.

［4］L Mia Kim，Daniel J King，David L Suarez，etal.Characterization of ClassⅠNewcastle Disease Virus Isolates from Hong Kong Live Bird Markets and Detection Using Real－Time Reverse Transcription－PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，4：1310－1314.

［5］刘秀梵.家养水禽A型流感和新城疫病毒的感染和临床疾病［C］.第15届世界禽病大会（中国畜牧兽医学会2007年学术年会）论文集，2007：87－95.

［6］胡北侠，黄艳艳，姜宁朋，等.蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征［J］.中国兽医杂志，2009，45（4）：9－12.

［7］Hu B，Huang Y，Zhang X，etal.Avian influenza virus and Newcastle disease virus（NDV）surveillance in commercial breeding farm in China and the characterization of ClassⅠNDV isolates［J］.Vet Microbiol，2010，144（1－2）：82－86.