鹅源坦布苏病毒的分离及初步鉴定

施少华，傅光华，万春和，程龙飞，陈红梅，黄振洲，黄 瑜

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州350013；3.广东省江门市台山都斛西敦兽医服务部，广东 江门529226）

2010年春夏之交，我国部分地区种鸭和蛋鸭发生以突发产蛋急剧下降为特点一种疾病。研究人员从表现产蛋骤降的病死禽中采集其卵巢、肝脏、脑等进行病毒分离，经对所分离的病毒进行形态学观察、理化特性测定、RT－PCR检测及序列分析明确该病病原为坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）［1－6］。之后相继有鸡和鹅感染TMUV的病例报告［7－9］。

2011年5～6月，广东江门的部分养鹅场20～30日龄雏鹅发病，临床症状主要表现为摇头、软脚，剖检可见肝脏出血、坏死，个别有心肌出血等现象。我们从患病鹅中分离到1株病毒，经RT－PCR检测和序列分析表明该病毒为TMUV。

1 材料与方法

1.1 酶、试剂 Trizol reagent RNA提取液，购自Invitrogen公司，反转录酶AMV Reverse Transcriptase、RNA酶抑制剂 Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mix、DNA Marker DL－2 000和pMD18－T载体，均购自宝生物工程（大连）有限公司，2×PCR Master Mix，购自Fermentas公司，琼脂糖凝胶回收小量试剂盒、质粒小量抽提试剂盒，购自Omiga公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞自制。

1.2 试验禽胚、试验动物及血清 13日龄鹅胚，购自广东江门某孵化场，10日龄番鸭胚购自福建莆田某孵化场。3日龄长乐灰鹅，购自福建长乐某养鹅场。抗鸭TMUV血清由鸭TMUV WR株免疫麻鸭制得。

1.3 病原分离 无菌采集呈典型病变的雏鹅肝脏，处理后接种于血琼脂平板培养基，于37℃有氧或烛缸培养48h，观察有无细菌生长。同时将雏鹅的肝脏剪碎后按照组织重量1∶4加入灭菌PBS，反复冻融3次后8 000r／min离心5min，取上清用0.22μm的过滤器除菌，滤过液经尿囊腔接种13日龄鹅胚6枚，0.2mL／胚；同时接种灭菌PBS作为对照。每天观察3次，弃24h内死胚。收集24～120h死亡鹅胚的尿囊液，进行无菌检查和鸡红细胞凝集试验后，－20℃保存备用。

1.4 病毒在番鸭胚的传代 将鹅胚的尿囊液接种10日龄番鸭胚4枚，0.2mL／胚；同时接种灭菌PBS作为对照。每天观察3次，弃24h内死胚，收集24～96 h死亡鸭胚的尿囊液，进行无菌检查和鸡红细胞凝集试验后，－20℃保存备用。

1.5 鸭胚半数致死量（ELD50）的测定 将待测病毒液用灭菌生理盐水作10－1～10－6稀释，分别接种于10日龄番鸭胚尿囊腔中，每个稀释度接种5枚，每枚0.2mL。每天照蛋2次，24h内死亡的鸭胚废弃不计，以后每天记录死亡情况，连续观察7d，按Reed－Muench法计算病毒对番鸭胚的ELD50。

1.6 中和试验 将新鲜病毒尿囊液按1∶10稀释，与已知的抗鸭TMUV血清等量混合，并用1∶10病毒液与灭菌生理盐水等量混合作对照。混合后置37℃1h，分别接种10日龄鸭胚，每枚0.2mL，每组5枚。每天观察3次，弃24h内死胚，共观察7d。

1.7 动物回归试验 将20只3日龄长乐灰鹅随机分成2组，每组10只。饲养观察7d后，A组肌肉注射新鲜病毒尿囊液，每只1mL，B组肌肉注射灭菌生理盐水，每只1mL。隔离饲养，每天观察2次，连续观察14d。

1.8 RT－PCR鉴定及序列分析

1.8.1 引物设计与合成 参照文献［10］合成可扩增469bp的鸭TMUV NS5基因片段的引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.8.2 RNA提取及反转录 取病毒株感染的番鸭胚尿囊液于10 000r／min（4℃）离心10min以去除杂质，收集上清液参照Trizol reagent说明书操作对病毒RNA进行提取，最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5μL DEPC水溶解。反转录按AMV Reverse Transcriptase说明书进行，具体如下：将制备好的RNA 5μL，加入200pmol／μL随机引物1μL，AMV RT 5×Buffer 4μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 8μL，40U／μL Ribonuclease Inhibitor 1μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL，混匀后按以下程序进行RT：42℃60min，99℃5min，保存于4℃。

1.8.3 PCR扩增 PCR反应体系为25μL：取2μL反转录产物，2× PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，dd H2O补齐至25μL后按以下程序进行PCR：95℃变性3min后，94℃变性40s，55.3℃退火40s，72℃延伸40s，共35循环，最后72℃延伸10 min，保存于4℃。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8.4 其他病原的排除 参照禽流感病毒、禽1型副黏病毒、鹅细小病毒、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新致病型鸭呼肠孤病毒基因序列设计引物，提取GD06株病毒的核酸，分别进行PCR或RT－PCR扩增。

1.8.5 克隆测序 PCR产物回收纯化后连接到pMD18－T载体，转化入DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16h，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、200r／min振荡过夜，取2μL菌液进行PCR鉴定，结果阳性者送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.8.6 序列比对分析 将所获得的测序结果用DNAStar软件包MegAlign程序进行比对，并通过MEGA 4.0分析遗传进化关系。参考毒株及其登录号：JS804株（JF895923），BYD－1株（JF312912），SD株（JN232077），Huabei株（JF523187），TMUV 14／6／82株（EU303233），以色列火鸡脑膜炎病毒（Israel turkey meningoencephalitis virus，ITV）（AF013377）。

2 结果

2.1 病原分离 从病死鹅肝脏取样接种于血琼脂平板，37℃培养后48h未发现有细菌生长，初步排除细菌感染的可能。病料样品接种鹅胚后在72h左右死亡，收集死亡鹅胚的尿囊液，经检验无细菌污染和病毒无血凝活性，暂命名为GD06株。

2.2 ELD50的测定 将待测病毒液用灭菌生理盐水作10－1～10－6共6个稀释度，分别接种于10日龄番鸭胚尿囊腔中，连续观察7d，算出ELD50＝10－1.84／0.2mL。

2.3 中和试验 将新鲜病毒尿囊液按1∶10稀释，与已知的抗鸭TMUV血清等量混合，置37℃1h，接种鸭胚，第3天有死胚1枚，而1∶10病毒液与灭菌生理盐水等量混合后接种鸭胚，7d内全部死亡。

2.4 动物回归试验 A组肌肉注射新鲜病毒尿囊液后死亡2只，剖检鹅肝脏有出血、坏死，将病变组织匀浆后接种10日龄鸭胚，可致鸭胚死亡，用RT－PCR检测结果为阳性，扑杀其他健活鹅未发现有明显的剖检病变。B组肌肉注射灭菌生理盐水无异常现象。

图1 鹅TMUV GD06株的RT－PCR／PCR检测

2.5 RT－PCR或PCR鉴定 用特异性引物对GD06株进行扩增，产物的电泳结果见图1。如图1所示，鸭TMUV特异性引物能成功扩增出1条约500bp的电泳条带，且空白对照无特异性条带。其他特异性引物均未能成功对其扩增出目的片段。

2.6 基因序列分析 将所扩增的目的片段进行回收纯化、克隆测序，经BLASTP检索可知，所克隆的基因片段与TMUV具有较高的同源性。对所获序列进行比对，结果见表1，分离株GD06与鹅源TMUV JS804株的核苷酸同源性高达99.8%，与鸭源TMUV（WR株、BYD－1株和SD株）核苷酸同源性分别为99.1%、99.8%和99.8%；与鸡源TMUV FQ－C1株的同源性高达98.5%，而与TMUV 14／6／82株的同源性为88.3%，与ITV的同源性为76.1%（TMUV与ITV的同源性则为74.4%）；氨基酸同源性比较表明，GD06株与BYD－1株、SD株、JS804株和Huabei株的同源性达100%，与鸡源TMUV FQ－C1株的同源性为98.1%，与TMUV的同源性也达96.8%。如图2所示，GD06株与鸭源、鹅源和鸡源TMUV的遗传进化关系近，它们共聚为同一分支，但与TMUV和ITV分立不同的进化分支。

3 讨论

黄病毒是一类具有囊膜的单链RNA病毒，包括黄热病病毒、乙型脑炎病毒、登革热病毒、坦布苏病毒、森林脑炎病毒、以色列火鸡脑膜炎病毒等。吸血的节肢动物，例如蚊和蜱等是黄病毒属的主要传播媒介。

表1 水禽源TMUV毒株之间及其与TMUV和ITV参考毒株之间NS5基因的同源性

图2 基于TMUV NS5基因构建的进化树

本试验自表现神经症状、软脚的病死鹅脏器中分离到病毒GD06株，经对分离的病毒株进行RTPCR鉴定及序列分析表明，初步确定GD06株病毒为TMUV。ELD50的测定结果显示，GD06株的毒力较低，进行血清中和试验时0.2mL的病毒液无法达到200ELD50的毒价，所以仅能进行简单的定性中和试验，其结果说明GD06株病毒与鸭TMUV抗原相关性强，动物回归试验也证明GD06株毒力弱。

序列分析表明，分离株GD 0 6与鹅源TMUV JS804株、鸭源TMUV（BYD－1株SD株）有极高的核苷酸（99.8%）及氨基酸（100%）同源性，但这三者之间宿主嗜性、致病性差异等关系如何需更加深入的研究。

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