氯离子通道ClC－2在非小细胞肺癌中的表达及意义

许哲男，郑向宇，赵 维，辛 华，韩振国＊

（1.吉林大学中日联谊医院 胸外科，吉林 长春130033；2.吉林大学白求恩医学院 病理生理教研室）

氯通道是分布于细胞膜上对氯离子或其他阴离子有通透性的电压门控氯通道（voltage－gated Cl channel，ClC），哺乳动物共有9个亚型，广泛存在于机体的细胞膜和细胞器膜，参与细胞的多种活动和功能调节过程。研究发现多种肿瘤组织中都存在ClC－2蛋白的过度表达和处于磷酸化状态。本研究以非小细胞肺癌为研究对象，与正常肺组织作为对比，探讨氯离子同通道ClC－2在非小细胞肺癌及肺部疾病中表达情况，亦探明氯离子通道ClC－2作为治疗非小细胞肺癌的基因靶位提供有利的依据，为治疗该肿瘤提供新的理论根据及途径。

1 材料和方法

1.1 实验材料 实验分组 正常肺组织为对照组，肺鳞癌、肺腺癌、肺良性病灶为实验组。肺良性病灶以肺结核为主，部分为肺大泡和炎性假瘤。组织标本购于吉林大学组织标本库，均收集于吉林大学中日联谊医院胸外科2008.05－2009.08经手术切除后保存的新鲜冷冻组织，提供标本的患者术前未经放、化疗等系统抗癌治疗。

1.1.2 试剂 总RNA提取Trizol试剂盒购于Invitrogen公司，PCR试剂购自TaKara公司。反转录试剂盒，核酸分子量标准品，Taq酶，人ClC－2抗体（购自美国Santa Cruz公司）为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的人抗体为二抗，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，M－MuLV RT、5XBuffer，M－MuLV RT Oligo d（T）Primers、购自（宝生物，日本），免疫组化超敏Ultrasensitive S－P试剂盒和DAB显示试剂盒（福州迈新公司），所有抗体均为即用型。

1.1.3 设备 低温高速离心机（久保田，日本），722分光光度计（上海仪器厂），PCR仪（TAKARA，日本），全自动数码凝胶成像分析系统（Tanon，中国），电泳仪（Bio－rad，美国），蛋白质电泳装置及转移系统（BioBrad，美国）。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 检测ClC－2mRNA的表达 应用Trizol试剂盒，按照试剂盒使用说明书对肺鳞癌及腺癌；肺良性病灶，正常肺组织分别提取总RNA。以上述所得总RNA为模板、Oligo（dT）为mRNA引物，应用SuperScriptⅡ试剂盒逆转录合成cDNA，以此为模板，用人ClC－2特异性引物对cDNA进行PCR特意扩增，详细操作步骤参见说明书。ClC－2引物序列

forward5′－AGGCTTCTGTCTGCTTCCA－3′；Reverse5′－TTCCAATGAGTCTGCCAATAC－3′。扩增的产物cDNA3′端大小约477bp。获得RTPCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离检验，用以上的方法检测实验组和对照组。

1.2.2 Western blot检测ClC－2蛋白的表达 按试剂盒说明书操作。采用凝胶成像系统摄像，软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 RT－PCR

利用ClC－2特意引物对逆转录成cDNA进行PCR扩增，结果显示在与DL2000DNA marker对应的250－500bp之间非小细胞肺癌组有一明显特异片段，肺良性病和正常肺组中其显示微弱，再与每个样品测得的目的基因含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的基因的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。结果表明非小细胞肺癌ClC－2基因表达量明显增加（见图1）。

图1 RT－PCR检测ClC－2及GAPDH的电泳结果

2.2 Western Blot

检测结果显示非小细胞肺癌组中ClC－2蛋白在98KD出有一条明显特征带，ClC－2／β－Actin趋势比较，表明非小细胞肺癌中鳞癌表达量最高，其次肺腺癌及良性病灶表达无明显差距，相比正常肺组织中ClC－2蛋白表达量比实验组降低，每组中氯离子通道ClC－2均有一定的表达（见图2）。

图2 Westemblot检测ClC－2蛋白的表达

3 讨论

ClC属电压门控性通道（voltage－gated chloride channels，ClC），在细胞的容积调节、细胞电位、细胞器的酸化及pH的调节、细胞的增殖、分化及凋亡，免疫细胞的募集及激活等多种病理生理过程中发挥重要作用［1，2］，近年来研究发现电压门控性氯离子通道在多种肿瘤细胞中表达异常，且可能在肿瘤细胞的发生、演化、增殖、细胞周期、侵袭转移及耐药性等恶性生物学行为中可能起重要作用［3，4］。

ClC－2是ClC的一员，其分布广泛，在大脑，肾脏及肠道的表达相对较高［5］。ClC通道家族成员的蛋白质功能性结构分析表明［6］，ClC通道蛋白质可能形成二聚体，具有“双筒枪（double－b－arreled）”通道结构。基因突变所造成ClC型氯离子通道蛋白质的结构异常，尤其是涉及功能的活性位点发生变化，是影响ClC型氯离子通道生理功能并发疾病的一个主要原因，例如CBS区域内（真核生物ClC蛋白中还有两个β－胱硫醚合酶）的点突变会影响通道的电压依赖性及ATP结合，导致一些遗传性疾病［7，8］，另外ClC型氯离子通道的基因缺陷或表达异常也会引起相应的生理变化或疾病。

电压门控性氯离子通道影响生物学行为的机制可能如下：（1）调节细胞内钙离子浓度，运用氯离子通道阻滞剂作用癌细胞后，细胞增殖能力降低，细胞周期停滞于G0／G1，同时细胞内钙离子浓度下降，这可能表明氯离子通道调节钙离子浓度，从而间接影响癌细胞的增殖和细胞周期［9］。（2）磷酸化调节cAMP依赖的激酶（PKA）和蛋白激酶C（PKC），可以刺激或抑制ClC－2的活性，活体外的磷酸化测定显示ClC－2可以被M时相特异同期蛋白依赖性激酶p34cdc2／细胞周期调节蛋白B（M－phase－specificcyclin－dependent kinase p34cdc2／cyclinB）磷 酸化［10］，显著降低 ClC－2电流。因此 ClC－2第632位丝氨酸－丙氨酸（S632A）突变消除了ClC－2的磷酸化位点，从而消除了p34cdc2／cyclinB对其功能的调节作用。（3）细胞体积调控机制，当细胞处在一个低渗环境时，水的被动流动引起细胞肿胀后水和离子外流，细胞的体积得以恢复，此过程称为细胞调节性体积下降（regulatory volume decrease，RVD），癌细胞在侵袭迁移过程中需要体积下降以“挤”过狭小的组织间隙。调节性细胞容积回缩（RVD），认为是当细胞暴露与低渗环境时，细胞膨胀，该膨胀会激活细胞的调节机制，使已增大的细胞容积减小并向正常体积转变。RVD被认为是细胞增殖、分化、迁移及细胞的凋亡密切相关的生理功能之一。研究发现鼻咽癌发生中，氯通道通过RVD参与了细胞增殖、侵袭及转移［11，12］。Soroceanu等分别证实，氯通道阻断剂能够抑制肿瘤的侵袭。肿瘤侵袭转移是一个序贯，复杂的过程，包括肿瘤细胞脱离原发灶、黏附基底膜和细胞基质，并对其水解破坏，癌细胞侵入周围脉管，继续生长形成转移癌，贯穿于整个过程，肺癌细胞的浸润可视为一个“主动”运动过程，通过癌细胞容积和形状的改变，具有浸润潜能的癌细胞来完成浸润及转移。有研究证实低渗环境下，腺癌细胞可实现容积的部分恢复，而鳞癌细胞可调节细胞回复原有的或甚至更小的容积，表明与正常肺组织相比，肺癌细胞具有较强的机制来控制细胞大小以保持其旺盛的生存能力，进而使细胞发生快速变形以增加其分裂增殖及浸润潜能。

本实验采用RT－PCR法和 Western blot法分别在基因和蛋白水平检测非小细胞肺癌、肺良性病及正常肺组织中ClC－2mRNA及ClC－2通道蛋白的表达程度，结果显示ClC－2基因产物为非小细胞肺癌中表达量明显高于肺良性病及正常肺组织，提示ClC－2可能与肺癌癌变的原始发生和进展过程中起到基因调控作用，与肿瘤发生、促进增长及浸润转移有关。ClC－2mRNA特异性表达升高在基因水平上赋予了肺癌细胞较强的氯离子转运能力，有利于细胞大小和形状的改变，从而导致瘤细胞易于分裂和侵袭转移。然而蛋白表达水平上肺良、恶性肿瘤与正常肺组织相比有明显表达增加，但良、恶性疾病之间无显著差异。这可能提示氯通道作为电压门控离子通道，广泛分布于人体的细胞器及细胞器膜，调节细胞体积。在肺部疾病发展过程中正常细胞向疾病转变，一系列遗传信息的改变可能会影响ClC－2蛋白的表达，或ClC－2蛋白的活性发生改变，从而导致无论是非小细胞肺癌，还是肺良性疾病，均会增加ClC－2蛋白表达量。

但ClC－2mNRA及ClC－2蛋白在正常组织和肺部良、恶性疾病中的表达差异及发生变异的ClC－2离子通道基因作用于肺恶性肿瘤生成，进展的哪个阶段等一系列问题必将会今后研究的重要方向。ClC－2也将成为非小细胞肺癌及肺部疾病诊的断与治疗提供新的基因靶位，对此，还需要进一步研究。

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