化癥散积颗粒对小鼠原位肝癌Bcl－2／Bax表达的影响

金学洙，李超英，周 磊，邢美茜，刘铁军

（长春中医药大学附属医院 肝病科，吉林 长春130021）

本实验通过建立小鼠原位肝癌模型，研究Bcl－2／Bax基因在化癥散积颗粒诱导小鼠原位肝癌发生凋亡过程中的作用与机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 IMDM培养基、新生牛血清购自Gibco公司；TUNEL原位末端凋亡检测试剂盒购自罗氏公司；Tizol mRNA提取试剂和逆转录酶购自Invitrogen公司；PCR试剂盒购自TAKARA公司；Bcl－2和Bax抗体购自Senta公司；引物合成由上海生工完成；化癥散积颗粒由长春中医药大学药物制剂研究室提供；阳性药物对照：复方斑蝥胶囊购自贵州益佰制药股份有限公司（批号：Z52020238）；鼠源性腹水型肝细胞癌细胞株H22（吉林省肿瘤研究所提供）；实验动物均购自吉林大学白求恩医学院实验动物研究所，昆明种小白鼠，4－6周龄，体重22－25g，雌雄各半。

1.2 细胞培养和传代 鼠源性腹水型肝癌H22细胞由本实验室常规培养于含10%新生牛血清的IMDM培养基中，37℃、5%的CO2培养箱中，经小鼠腹腔传代后备用。

1.3 小鼠原位肝癌模型的建立 取腹腔接种H22肝癌细胞株后7d的昆明种小鼠，无菌抽取H22肝癌细胞株腹水，生理盐水洗涤，离心1 000r／min，5 min弃上清，台盼蓝染色计数，生理盐水调整癌细胞数至1×108／ml备用。健康昆明种小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，小鼠仰卧固定，备皮，常规消毒铺巾，于上腹正中剑突下作一约1cm的切口。轻压双侧肋弓以挤出部分肝叶，湿纱布垫于肝叶下方以保护，然后用0.25ml医用注射器针头沿肝叶长轴方向插入缓慢注入H22肝癌细胞悬液0.03ml（细胞数为3×106）。在拔出针头的同时，迅速用棉签轻压1min止血，然后在针眼周围用酒精棉球轻搽。小心地将肝脏回纳入腹腔，缝合切口术毕。术后正常饮水、进食［3］。

1.4 动物分组及给药 将瘤源小鼠分为5组，每组10只。实验分组如下：A.阳性对照组（简称斑蝥组或FB）B.模型组（简称mock）；C.低剂量治疗组（简称Low）；D.中剂量治疗组（简称 Medium）；E.高剂量治疗组（简称High）；化癥散积颗粒低、中、高用法为：1.95g／kg，3.9g／kg，7.8g／kg，灌胃1次／d，治疗组连续14d，复方斑蝥胶囊用法为：0.19g／kg，灌胃1次／d，14次。模型组生理盐水每天灌胃1次，连续14d，于末次给药后24h，颈椎脱臼法处死小鼠，取肿瘤组织。

1.5 凋亡细胞的TUNEL检测 按试剂盒说明书操作。荧光显微镜下成像，激发波长为450－500 nm，检测波长为515－565nm（绿色荧光）。按说明书设立阴性对照。200倍视野下选取5个视野，计算并比较肿瘤组织原位细胞凋亡率。

1.6 RT－PCR 检测 Bcl－2和 Bax的 mRNA 表达给药后取新鲜肿瘤组织，按照试剂盒说明书提取总mRNA，逆转录成cDNA。采用cDNA为模板，分别用Bcl－2、Bax和β－actin引物进行 PCR 反应，30个循环后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用天能凝胶成像系统拍照并分析条带吸光度，实验重复3次。结果以目的基因和内参基因β－actin比值表示。各引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 Western－blot检测 Bcl－2、Bax的蛋白表达按试剂盒说明书操作。DAB法显色。膜采用天能凝胶成像系统拍照并进行条带吸光度分析，实验重复3次，结果以目的蛋白和内参蛋白β－actin比值表示。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.0软件对实验结果数据进行统计分析。实验结果采取均数±标准差（±s）表示。P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 TUNEL染色检测晚期凋亡细胞 如图1所示，在荧光显微镜下观察肝癌组织原位的细胞凋亡情况，凋亡细胞被染成绿色，通过对5个不同视野的凋亡细胞计数，结果显示，FB、Medium和High组细胞凋亡率均明显增加，与对照组相比具有明显差异（P＜0.05，n＝5），而Low组虽然可以观察到凋亡细胞但是其细胞计数与对照组相比无明显差异（P＞0.05，n＝5）。

图1 荧光显微镜下的TUNEL染色结果（×200）和凋亡细胞计数统计

2.2 RT－PCR检测Bcl－2和Bax mRNA表达 如图2所示，通过对以β－actin作为内参校正后条带进行密度扫描分析，可以发现在斑蝥组、中剂量和高剂量组的肿瘤组织中的Bcl－2mRNA表达水平明显低于模型组（P＜0.05），Bax mRNA水平则明显高于模型组（P＜0.05）；低剂量组Bcl－2和Bax mRNA水平与模型组相比稍高，但无统计学差异（P＞0.05）。

图2 RT－PCR检测不用给药组肿瘤组织中Bcl－2和Bax的mRNA表达

2.3 Western－blot检测Bcl－2和Bax蛋白表达

如图3所示，肿瘤组织中的Bcl－2蛋白表达在FB、Medium和High组中表达明显低于模型组和Low组（P＜0.05），Bax在FB、Medium和 High组中表达明显高于模型组（P＜0.05），Low组与模型组相比无明显差异。通过上图我们可以看出，Bcl－2／Bax蛋白表达的比值在不同组也有差异，其中FB、中剂量组和高剂量组比值明显小于模型组（P＜0.05），而低剂量组比值与模型组无明显差异（P＞0.05，n＝5）。

图3 Western－blot检测不同给药组Bcl－2和Bax的蛋白表达

3 讨论

细胞凋亡或程序性细胞死亡是细胞在一定的生理或病理条件下遵循自身的程序“自杀”，最后脱落离体或形成多个凋亡小体被其它细胞吞噬。诱导凋亡是目前药物治疗肿瘤的重要方向和方法。实验中我们通过TUNEL染色法检测了不同给药组和模型组的细胞凋亡情况，结果发现模型组肿瘤细胞只发现很少凋亡细胞，而斑蝥组、中剂量组和高剂量组肿瘤细胞凋亡明显增加，且对照组相比具有明显差异（P＜0.05，n＝5），但是低剂量组凋亡细胞与对照组相比无明显差异（P＞0.05）。

Bcl－2家族蛋白是一组与细胞凋亡密切相关蛋白，其产物主要定位于细胞质膜如线粒体膜、核周膜和内质网。Bcl－2具有凋亡拮抗作用。Bax的细胞内定位与Bcl－2类似，限于部分细胞核膜、线粒体外膜及内质网膜、胞浆。其作用与Bcl－2促细胞存活（抗凋亡）的作用相反，Bax基因可以促细胞发生凋亡［4，5］。生物学研究已经 证实 Bcl－2 与 Bax 在体内形成同或异二聚体而发挥抗凋亡作用。本实验首先应用免疫组织化学染色的方法定位检测了Bcl－2和Bax在各组肿瘤细胞中的表达情况，结果显示Bcl－2在模型组肿瘤细胞中高表达，低剂量组表达与模型组相比无明显差异，而斑蝥组、中剂量和高剂量组肿瘤细胞中的Bcl－2则呈低表达；Bax表达情况与Bcl－2完全相反，在模型组和低剂量组中低表达，而在斑蝥组、中剂量以及高剂量组肿瘤细胞胞浆中高表达。同时我们通过RT－PCR的方法检测了Bcl－2和Bax在mRNA水平即转录水平的表达变化，结果显示通过对以β－actin作为内参校正后条带进行密度扫描分析，可以发现的肿瘤组织中的Bcl－2mRNA水平在FB、Medium和High组明显低于模型组（P＜0.05），Bax mRNA水平则明显高于模型组；低剂量组Bcl－2和Bax mRNA水平与模型组相比稍高，但无统计学差异（P＞0.05）。Bcl－2与Bax mRNA和蛋白表达浓度的比值趋势一致，斑蝥组、中剂量和高剂量组明显低于模型组和低剂量组。结果说明Bcl－2在转录水平上表达减少，而Bax在转录水平表达增多，这种改变可能促进细胞引发凋亡级联反应。

通过以上实验从原位肝癌小鼠给药实验证明了，化癥散积颗粒可抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞发生凋亡。在研究肿瘤生长抑制机制的过程中，我们从细胞凋亡入手，探讨了凋亡相关基因Bcl－2和Bax的表达改变，证明化癥散积颗粒可能是通过减少抑制凋亡基因Bcl－2表达，同时增加促凋亡基因Bax表达诱导肿瘤细胞发生凋亡。

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［2］Parkin FDM.Global cancer statistics in the year 2000［J］.Lancet Oncol，2001，2（9）：533.

［3］李超英，杨春荣，张大方，等.彩超应用于小鼠原位肝癌移植模型的评价［J］.中华中医药杂志.2008，23（12）：1064.

［4］Pan G，O＇rourk e K，Dixit VM.Caspsae－9，Bcl－Xl，an d Apaf－1format ernary complex［J］.J Biol Chem，1998，273：5841.

［5］Hu Y，Benedi ct M A，Wu D，et al.Bcl－XL interact s with Apaf－1 and inhibits［J］.Proc Natl Acad Sci，1998，95：4386.