社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的同源性及PVL毒素研究

潘宏升，荀凤娇，田素飞，年 华，褚云卓＊

（1.中国医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 沈阳110001；2.辽宁省第三人民医院 检验科）

目前，全球范围内由社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趋势，CA－MRSA与医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（HA－MRSA）存在许多不同，CA－MRSA多感染无相关危险因素的健康人群，且发病年龄较轻［1］；其常携带多种与致病力相关的外毒素，其中杀白细胞（PVL）毒素被证实能够引起坏死性筋膜炎、败血症、中毒休克综合征等多种进行性、坏死性疾病［2］，严重者甚至死亡。因此，有必要对CA－MRSA进行毒力检测及同源性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2007年1月至2008年9月门诊及住院患者连续分离、不重复非痰标本CAMRSA菌株5例，其中浓汁3份，血液2份。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组提取试剂盒，博日生物技术有限公司；Taq酶及PCR相关试剂，宝泰克大连生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脉冲场凝胶电泳试剂，美国Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脉冲场凝胶电泳仪（美国Bio－Rad），HZQ－F160振荡培养箱（上海）；超速低温离心机（贝克曼）；紫外凝胶成像仪（美国Alpha Innotech）。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用细菌基因组提取试剂盒，按照说明提取基因组DNA。

1.2.2 PVL基因检测 引物设计及参数参照文献［3］，上 游 引 物：5’－ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA－3’，下 游：5’－GCAT－CAACTGTATTGGATAGCAAAAGC－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因经PCR扩增阳性，片段大小与预计值相符，产物经上海生工有限公司纯化、测序，在GenBank比对确证。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳分析 新鲜菌株包埋于1%低熔点琼脂中，溶葡球菌素及溶菌酶进行破壁（37℃，2h），蛋白激酶 K原位消化（50℃，48h），经限制性内切酶SmaI酶切（25℃、140r／min，4h）；参数：电场强度6V／cm，温度14℃，角度120°，脉冲时间5－40s，电泳22h，EB染色20min，分析结果。结果判定标准：酶切后图谱完全一致为A型；图谱与A比较，3条带差异以下者为同一型的不同亚型，4－6条者为不同基因型。

2 结果

2.1 脉冲场凝胶电泳结果

3株SCCmec基因型Ⅳ型菌株为同一克隆株A型，2株Ⅴ型菌株分别为A1、A2亚型，电泳结果见图1。

图1 脉冲场电泳结果

2.2 PVL基因检测

结果显示3株SCCmecⅣ型CA－MRSA分离株PVL基因阳性（其测序结果见图2）。

图2 PVL基因测序结果

3 讨论

自从1997年在纽约首次发现社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染以来，全球范围内关于CA－MRSA感染的报道接连不断，其较强的传播能力和定植能力及其携带的毒力基因对于疾病的发生、发展都起到了十分重要的作用，使其易造成感染的暴发和流行，引起发病率和死亡率升高。

PFGE方法是进行染色体DNA分型，将基因组的整体基因片段进行分析，主要应用于近期内引发感染疾病的菌株间同源性分析，其分辨能力强，被誉为基因分型技术的“金标准”。本研究发现，3例CA－MRSA菌株（P14、2997、E14）PFGE图谱一致，其余2株为该型的不同亚型，具有高度的同源性。

虽然文献［4］显示C A－MRSA在基因结构上仅携带对β－内酰胺类抗菌药物耐药的mecA基因耐药程度较低，但与HA－MRSA不同携带多种毒素，其独力更强，本研究显示5株CA－MRSA中有3株携带PVL毒素，远高于 HA－MRSA［5］。应引起临床广泛注意。

［1］Jenum PA，Walberg M，Rønning EJ，et al.An outbreak of methicillin－resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward［J］.Tidsskr Nor Laegeforenk，2008，17；128（8）：933.

［2］Delaney JA，Schneider－Lindner V，Brassard P，et al.Mortality after infection with methicillin－resistant Staphylococcus aureus（MRSA）diagnosed in the community［J］.BMC Med，2008，6：2.

［3］Vandenesch F，Naimi T，Enright MC，et al.Community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus carrying Panton Valentine leukocidi genes：world wide emergence［J］.Emerg Infect Dis，2003，9：978.

［4］Gorwitz，RJ，Jernigan，DB，Powers，JH，et al.In the CDC－Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community：summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention［G］.

［5］Gillet Y，Issartel B，Vanhems P.Association between Staphylococcus aureus strains carrying the gene for Panton-Valentine leukocidin and hightly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients［J］.Lancet，2002，359：753.