社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的同源性及PVL毒素研究
2012-11-05潘宏升荀凤娇田素飞褚云卓
潘宏升,荀凤娇,田素飞,年 华,褚云卓*
(1.中国医科大学附属第一医院 检验科,辽宁 沈阳110001;2.辽宁省第三人民医院 检验科)
目前,全球范围内由社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)引起的感染呈逐年上升趋势,CA-MRSA与医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)存在许多不同,CA-MRSA多感染无相关危险因素的健康人群,且发病年龄较轻[1];其常携带多种与致病力相关的外毒素,其中杀白细胞(PVL)毒素被证实能够引起坏死性筋膜炎、败血症、中毒休克综合征等多种进行性、坏死性疾病[2],严重者甚至死亡。因此,有必要对CA-MRSA进行毒力检测及同源性分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 收集2007年1月至2008年9月门诊及住院患者连续分离、不重复非痰标本CAMRSA菌株5例,其中浓汁3份,血液2份。
1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组提取试剂盒,博日生物技术有限公司;Taq酶及PCR相关试剂,宝泰克大连生物科技有限公司;PCR引物,上海生工有限公司合成;脉冲场凝胶电泳试剂,美国Bio-Rad生物科技有限公司;PCR9700(Gene Amp);脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad),HZQ-F160振荡培养箱(上海);超速低温离心机(贝克曼);紫外凝胶成像仪(美国Alpha Innotech)。
1.2 方法
1.2.1 DNA模板提取 采用细菌基因组提取试剂盒,按照说明提取基因组DNA。
1.2.2 PVL基因检测 引物设计及参数参照文献[3],上 游 引 物:5’-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3’,下 游:5’-GCAT-CAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3’。
1.2.3 基因序列分析 目的基因经PCR扩增阳性,片段大小与预计值相符,产物经上海生工有限公司纯化、测序,在GenBank比对确证。
1.2.4 脉冲场凝胶电泳分析 新鲜菌株包埋于1%低熔点琼脂中,溶葡球菌素及溶菌酶进行破壁(37℃,2h),蛋白激酶 K原位消化(50℃,48h),经限制性内切酶SmaI酶切(25℃、140r/min,4h);参数:电场强度6V/cm,温度14℃,角度120°,脉冲时间5-40s,电泳22h,EB染色20min,分析结果。结果判定标准:酶切后图谱完全一致为A型;图谱与A比较,3条带差异以下者为同一型的不同亚型,4-6条者为不同基因型。
2 结果
2.1 脉冲场凝胶电泳结果
3株SCCmec基因型Ⅳ型菌株为同一克隆株A型,2株Ⅴ型菌株分别为A1、A2亚型,电泳结果见图1。
图1 脉冲场电泳结果
2.2 PVL基因检测
结果显示3株SCCmecⅣ型CA-MRSA分离株PVL基因阳性(其测序结果见图2)。
图2 PVL基因测序结果
3 讨论
自从1997年在纽约首次发现社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)引起的感染以来,全球范围内关于CA-MRSA感染的报道接连不断,其较强的传播能力和定植能力及其携带的毒力基因对于疾病的发生、发展都起到了十分重要的作用,使其易造成感染的暴发和流行,引起发病率和死亡率升高。
PFGE方法是进行染色体DNA分型,将基因组的整体基因片段进行分析,主要应用于近期内引发感染疾病的菌株间同源性分析,其分辨能力强,被誉为基因分型技术的“金标准”。本研究发现,3例CA-MRSA菌株(P14、2997、E14)PFGE图谱一致,其余2株为该型的不同亚型,具有高度的同源性。
虽然文献[4]显示C A-MRSA在基因结构上仅携带对β-内酰胺类抗菌药物耐药的mecA基因耐药程度较低,但与HA-MRSA不同携带多种毒素,其独力更强,本研究显示5株CA-MRSA中有3株携带PVL毒素,远高于 HA-MRSA[5]。应引起临床广泛注意。
[1]Jenum PA,Walberg M,Rønning EJ,et al.An outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward[J].Tidsskr Nor Laegeforenk,2008,17;128(8):933.
[2]Delaney JA,Schneider-Lindner V,Brassard P,et al.Mortality after infection with methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)diagnosed in the community[J].BMC Med,2008,6:2.
[3]Vandenesch F,Naimi T,Enright MC,et al.Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying Panton Valentine leukocidi genes:world wide emergence[J].Emerg Infect Dis,2003,9:978.
[4]Gorwitz,RJ,Jernigan,DB,Powers,JH,et al.In the CDC-Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community:summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention[G].
[5]Gillet Y,Issartel B,Vanhems P.Association between Staphylococcus aureus strains carrying the gene for Panton-Valentine leukocidin and hightly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients[J].Lancet,2002,359:753.