沙棘皮渣中哈尔满碱制备技术研究

山永凯

（青海青美生物资源研究开发有限公司，青海西宁 810016）

沙棘，又称醋柳、酸刺，是一种多年生的灌木或小乔木，属于胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（HippophaeL.）［1，2］富含生物活性物质的天然植物［3］。沙棘果中除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物外，还有人体必需的多种维生素和无机盐，其中维生素含量丰富，尤以VC含量为高，几乎居一切果蔬之冠。

沙棘果具有很高的食用和药用价值。沙棘果含有沙棘黄酮、超氧化物歧化酶（SOD）、ω－6多不饱和脂肪酸、哈尔满碱、5－羟色胺等对人体具有特殊保健作用的生物活性物质。具有活血化瘀、化痰宽胸、补脾健胃、生津止渴、清热止泻、消炎生肌、抑制肿瘤等功效。沙棘产品在食品和药品行业被广泛应用，倍受企业和相关行业的青睐［4］。

哈尔满碱（Harmane），异名去甲氧去氢骆驼蓬碱；2－甲基－B－咔啉；3－甲基－4－咔啉，广泛存在于最大革盖菌（Coriolusmaximus）、蘑菇和植物体，属于B－咔啉生物碱。分子式为C12H10N2，分子量为182.22，结构式见图1。为黄褐色粉末或结晶体，熔点230～232℃，在紫外灯下呈亮蓝色荧光。主要用于真菌所致的癣类皮肤病、湿疹、烧伤、静脉曲张性溃疡等症（趾间发癣菌，MIC＝1.6～200.0μg／mL）；低剂量时为运动抑制剂，高剂量时引起惊厥；抑制活性钠转移，Na＋，K＋－腺苷三磷酸酶抑制剂；植物生长调节剂；子宫兴奋剂。临床上将哈尔满用于治疗肾上腺素或去甲肾上腺素水平低下所引起的疾病。可活血散瘀、治咳嗽、劳伤吐血、跌打、月经不调。

图1 哈尔满碱结构式

沙棘的根、茎、叶、花、果都含有丰富的生理活性物质和哈尔满碱。目前哈尔满碱大多从茜草科植物蛇根草（OphiorrhizajaponieaBl.）的全草中提取，而以沙棘果皮渣为原料提取哈尔满碱在国内还未见报道。所以，以生产下脚料——沙棘皮渣为原料，提取哈尔满碱，不仅可以提高沙棘产品的附加值，而且实现了原料的优化配置。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

沙棘果（青海清华博众生物技术有限公司）；沙棘皮渣；乙醇；大孔树脂。

1.1.2 仪器设备

超声波提取机；液相色谱仪；干燥箱；离心机；粉碎机等。

1.2 提取流程及操作要点

1.2.1 提取工艺流程

本实验的工艺过程分为二部分。

第一部分是沙棘的前处理。沙棘果是资源利用的源头，通过对不同部位原料的处理，可以得到沙棘果汁、沙棘种籽等用于高附加值产品开发的产品，沙棘皮渣经过干燥粉碎后，用来进行下一步实验，提取目标产物。工艺流程如下：

第二部分是目标产物的提取，工艺流程如下：

1.2.2 操作要点

（1）沙棘果枝条的采收和清洗

采集的带果沙棘枝条长度小于5cm，粗小于6mm，可带少许叶；剔出生青果、病烂果和泥浆果，以及石块、金属器具等硬物、异物。采集的沙棘果须用木制或竹制容器盛装，不得用其他材料制成的容器盛装。清洗用水必须符合GB5749的规定，加工环境要清洁卫生，尽量消除有害生物的发生繁殖，防止有害生物接触加工和处理设备。

（2）离心取汁

沙棘果经冲洗干净后用PK－121R 离心机高速（4000 转／min）离心分离，得清汁，清汁收集后用于生产沙棘汁为原料的其他产品，如沙棘饮料、沙棘酒、沙棘果醋、沙棘口服液、沙棘果粉、沙棘维生素P 粉等产品。沙棘果离心机转速要求3500～4500 转／min、离心6min 时，出汁率达78%以上。

（3）种籽与果皮的分离

沙棘果经离心机高速（4000 转／min）离心分离后得到果皮与种籽，经过晾晒、脱皮、筛选等工序，分离出其中的沙棘种籽、枝条，收集果皮渣。沙棘果皮渣经过干燥、粉碎、过筛后备用，做为提取哈尔满碱的原料。

（4）目标产物的提取

采用超声波提取法，以乙醇为溶剂，通过实验，确定适宜的乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间及提取次数，得出哈尔满碱最佳提取参数。

（5）树脂纯化

将大孔树脂D101用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨胀，湿法装柱，然后用95%乙醇液洗至流出液无白色混浊现象，再用去离子水洗净乙醇，直至流出液无浑浊为止。取最佳优化工艺的提取液，确定提取液与树脂用量（柱体积）比约为1∶1（g／mL）上样，选用洗脱剂为80%乙醇，洗脱体积为5个柱体积，收集洗脱液，薄层层析判断有效成分。有效洗脱成分减压浓缩滤液，真空干燥。

（6）检测

对所得的目标提取物，用高效液相色谱法进行测定。

1.3 实验测定

1.3.1 检测波长的确定

取哈尔满碱对照品适量，加甲醇稀释后作为对照品溶液，以甲醇为参比，用紫外分光光度计在200～400nm 波长范围内扫描，测定哈尔满碱在280nm 和335nm 处有较大的吸收，经试验比较最后确定选择280nm 为检测波长。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Shim－pack ODS C18柱（6.0mm×150mm，5μm），流 动 相：V（甲 醇）：V（0.025mol／L磷酸三乙胺）＝20：80，检测波长280nm，流速1ml／min，柱温40℃，理论塔板数按哈尔满碱峰计算应不低于2000。

图2 哈尔满碱对照品的HPLC图谱

1.3.3 流动相的选择

采用不同体系的流动相进行比较试验，结果发现以V（甲醇）∶V（0.025mol／L 磷酸三乙胺）＝20∶80为流动相条件下，供试液中哈尔满碱与相临组分分离度良好，且保留时间适宜，方法 重复 性好。故选 择 V（甲 醇）∶V（0.025mol／L 磷 酸三 乙 胺）＝20∶80 作 为 流动相。

1.3.4 对照溶液的制备

精密称取干燥至恒重的哈尔满碱对照品0.00339g，置100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。即得0.0339mg／mL的对照品溶液。

1.3.5 样品溶液的制备

精密称取提取物0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇50mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减少的质量，摇匀，过滤，精密量取过滤液5mL，置25mL 棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。色谱图见图3。

1.3.6 线性关系

精密吸取浓度为0.0339mg／mL 的哈尔满对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，按上述色谱条件测定峰面积，以哈尔满对照品峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程如下：Y＝35678.9321x＋59578.1069，相关系数r＝0.9991。

图3 哈尔满碱样品的HPLC图谱

结果表明，哈尔满碱的进样量在0.0678～0.3391μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

1.3.7 精密度实验

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，各进样5次，测定供试品溶液中哈尔满碱峰面积和对照品的RSD 分别为1.95%和0.39%（n＝5），结果表明精密度良好。

1.3.8 稳定性实验

在上述色谱条件下，精密吸取同一供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪测定，然后隔12h各考察1次。结果表明，供试品溶液至少在48h内测定结果稳定，供试品溶液哈尔满碱峰面积的RSD 为2.4%（n＝5）。

1.3.9 重复性实验

称取提取物0.5g，共5 份，按样品溶液制备方法制备供试品溶液；对照品溶液浓度为0.0339mg／mL。按含量测度方法进行测定，测得哈尔满碱的平均含量为0.02260%，RSD 为1.10%（n＝5），说明本方法重复性良好。

1.3.10 回收率试验

取已知哈尔满碱含量的沙棘皮渣5g，称定，共称取5份，分别置具塞锥形瓶中，各分别加入一定量的哈尔满碱对照品，按供试品制备方法制成供试品溶液，并按含量测定方法进行测定，按以下公式计算回收率。

实验结果表明，哈尔满碱平均回收率为96.11%（n＝5），RSD＝1.71%。说明该测定方法测定结果准确。

1.3.11 样品含量的测定

取制备好的提取溶液，在上述色谱条件下进样，测定峰面积，平行3次，按外标法计算平均含量。

2 试验结果与分析

2.1 原料的得率

为了比较准确地计算目标产物的实际含量与提取率，首先对所使用的实验原料沙棘皮渣在沙棘中的得率进行了测定，结果见表1。

表1 离心取汁后沙棘皮渣的得率

实验的沙棘果，经过取汁、取籽后得到约3.75%的沙棘皮渣。

2.2 哈尔满提取实验

本实验采用超声波提取法对哈尔满碱进行提取，在提取过程中，分别对各种影响因素进行筛选，对影响较大的因素进行实验，确定出各种方法的最佳因素水平组合。

2.2.1 提取单因素实验

超声波提取法提取目标产物时，确定5个单因素为乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数、pH 值。试验因素水平表见表2。

表2 试验因素水平

2.2.2 响应面分析试验

根据Box－Benhnken 中心组和试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析方法，根据单因素试验结果选取因素水平。试验因素水平设计见表3。

表3 试验因素水平

2.3 提取单因素试验结果

图4 乙醇体积分数对哈尔满碱得率的影响

2.3.1 乙醇体积分数对哈尔满碱得率的影响

由图4可知，乙醇体积分数增大，哈尔满碱的得率也增大。这与所提取物质的结构有关。乙醇体积分数增大，提取物的溶解性增大。因此，得率随乙醇体积分数的增大而增加；但是当乙醇体积分数过高时，其它组分也大量溶出，另一方面也增加了成本，并为乙醇回收带来困难，综合考虑乙醇体积分数以90%左右较好。

图5 液料比对哈尔满碱得率的影响

2.3.2 液料比对哈尔满得率的影响

从图5可知，料液比对哈尔满碱得率有影响。当液料比小于35时，哈尔满碱得率增加较快，当液料比大于35时，得率有所下降。这可能是由于溶剂添加量增大，有效成分在由固体组织向外扩散的过程中，浓度梯度增大，扩散速率提高，有利于提高得率。因此选择液料比为35适宜。

图6 提取时间对哈尔满碱得率的影响

2.3.3 提取时间对哈尔满碱得率的影响

由图6可知，不同提取时间对哈尔满碱得率影响不大。这是由于超声波提取，能够使细胞在很短的时间内破碎，溶剂能迅速渗透到细胞内部，而且目标提取物能够快速达到溶解平衡，因此提取时间较短。延长提取时间并不能明显增加哈尔满碱得率。因此，选择提取时间为70min为宜。

图7 提取次数对哈尔满碱得率的影响

2.3.4 提取次数对哈尔满碱得率的影响

由图7可知，提取次数为1－3次时，哈尔满碱得率增加迅速，当提取次数大于4次时，哈尔满碱得率反而降低，其原因可能是提取液体积较大时，浓缩时受热时间长，使哈尔满碱破坏。为了节约溶剂、节省浓缩时间，采用2 次提取适宜。

2.3.5 提取温度对哈尔满碱得率的影响

如图8可知，可以看出适当的提高提取温度会使得率增加，在温度为70℃时提取率达到最大值，随着温度的继续提高，提取率趋于下降。可能是温度过高会使得哈尔满碱发生化学反应含量降低。故选择70℃左右。

图8 提取温度对哈尔满碱得率的影响

2.4 响应面试验结果与分析

2.4.1 试验结果

选取乙醇体积分数、提取时间、提取温度，以哈尔满碱得率为响应值Y，试验设计与结果见表4。其中1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计实验误差。

表4 试验设计与结果

2.4.2 回归方程

乙醇体积分数（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）对哈尔满碱得率的曲面拟合方程为：

由回归方程得出，在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：X2＞X3＞X1，即：提取时间＞提取温度＞乙醇体积分数。经SAS软件运行得出，最佳工艺参数是：乙醇体积分数为74%，提 取 时 间 为72min，提 取 温 度为72.6℃。

图9 三因素响应面图

2.5 大孔树脂纯化

采 用 AB－8、ADS－3、ADS－5、NKA－9、D101、D4006五种大孔吸附树脂进行吸附对比试验，从中选择分离效果好，吸附容量大，容易洗脱和再生的树脂作为纯化目标产物的层析柱填充料。采用梯度洗脱的方法，使杂质与目标产物分离。依次选用蒸馏水、30%、50%、70%、90%（V／V）乙醇（pH＝8）溶液作为层析柱洗脱剂，结果显示，选用D101吸附树脂，在流速为1mL／min，收集乙醇体积分数为90%时的洗脱液，所得目标产物纯度最高。

2.6 提取率计算

通过所设计工艺进行沙棘皮渣中哈尔满碱的提取和分离，1000g沙棘皮渣中可提取到32%的7.67g哈尔满碱提取物。

3 结论

本研究对沙棘皮渣中提取哈尔满碱的工艺进行了全面的分析和研究。采用超声波提取法，以乙醇为溶剂，通过实验，得出哈尔满碱最佳提取参数。确定适宜的乙醇体积分数为90%、提取温度为70℃、料液（V∶m）比35，提取时间70min，提取次数为2次，提取液经大孔树脂纯化，最后用高效液相色谱法检测目标产物含量。通过所设计工艺进行沙棘皮渣中哈尔满碱的提取和分离，1000g沙棘皮渣中可提取到32%的哈尔满提取物7.67g。

沙棘产业的发展将促进我国三北地区经济发展，帮助农民增加收入，可实现社会经济与生态环境的协调和可持续发展，符合发展和谐社会的宗旨。发展沙棘产业使沙棘资源保护和开发并举，有利于农村调整产业结构和经济协调发展。本实验将沙棘产品的下脚料沙棘皮渣进行利用，增加了沙棘产品的开发深度，但应该继续提高本研究所属哈尔满碱的纯度和提取率，并研究更好的分离技术，开发高纯度生物药用原料。在提取沙棘哈尔满碱的同时，在废弃的原料中进一步分离提取沙棘黄色素、原花青素等高价值生物物质，可提高提取过程中生物成分的最大利用度和综合利用程度。

［1］张锦芳，鲁长征 .保健沙棘醋酸饮料的研制［J］.国际沙棘研究与开发，2005（3），10.

［2］黄铨，于倬德.沙棘研究 ［M］.北京：科学出版社，2006.6.

［3］鲁长征，曾端国，刘洪智.HACCP系统在沙棘酒生产中的应用 ［J］.国际沙棘研究与开发，2007（3），9.

［4］鲁长征，山永凯，刘洪智.液态法沙棘醋生产及其醋酸饮料的研制 ［J］.饮料工业，2008（12）：18－21.