“鸡皮糙”山药过氧化物酶的酶学特性*

李宁，董海洲，王兆升，李钟涛，李睿

(山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安，271018)

“鸡皮糙”山药产自山东省菏泽市陈集镇，粉性足、多须根、质腻、味甘甜、质地硬、入水久煮不散、不易折断、营养价值高，现已申请了国家地理标志保护产品［1］。但在山药加工和贮藏过程中往往产生剧烈褐变，失去原有的乳白色泽，严重影响产品的外观、风味及商品价值。果蔬的褐变主要由酶促褐变引起，与酶促褐变密切相关的酶类主要有多酚氧化酶(PPO)和POD［2］。目前，国内对山药酶促褐变的研究主要集中在PPO上，但Chilaka等人认为，POD在山药褐变上也起着重要作用［3］。

POD是广泛分布于植物中的一类氧化还原酶，可催化由过氧化氢参与的各种还原物质的氧化反应。它能催化过氧化物对酚类物质的氧化，导致组织褐变［4］。果蔬中大部分的风味改变和褐变与POD活力有关，POD的活力改变明显地影响果蔬产品的质量［5］。目前，关于“鸡皮糙”山药POD酶学特性的研究尚未见报道。为此，本研究以新鲜“鸡皮糙”山药为材料，对其POD进行较为系统的酶学特性研究，以期为控制过氧化物酶引起的酶促褐变、减少其营养损失提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

“鸡皮糙”山药:产地为菏泽市陈集镇，新鲜优质(无病虫害及机械损伤)。

1.2 试剂与仪器

PVP(交联聚乙烯吡咯烷酮)、Na2HOP4、柠檬酸、愈创木酚、H2O2、NaHSO3、草酸、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)、抗坏血酸、L-半胱氨酸等，均为分析纯。

研钵、数显恒温水浴锅、TGL16台式高速冷冻离心机、AY202型电子天平、PHS-25型酸度计、T6新世纪紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 “鸡皮糙”山药POD酶液的制备

称取清洗去皮后的“鸡皮糙”山药10 g于研钵中，加入2%的PVP、50 mL 0.1 mol/L pH 6.0的柠檬酸－磷酸盐缓冲液在冰浴条件下研磨成浆，4℃下浸提30 min后用4层纱布过滤。使用冷冻离心机以4 000 r/min将滤液离心15 min，取上清液，上清液即为POD粗酶液。

1.3.2 POD 活性的测定［6］

取pH6.0柠檬酸－磷酸缓冲液(0.1 mol/L)1.7 mL，分别加入1 mL浓度为40 mmol/L愈创木酚和浓度为40 mmol/L H2O2溶液(其最终体系中浓度为10 mmol/L)混匀，25℃下保温5 min，加入0.3 mL POD粗酶液启动反应，对照组以缓冲液代替酶液。在470 nm波长下测定吸光度的变化，每隔30 s记录1次，共计3 min。1个酶活力单位定义为:测定条件下，每分钟每毫升酶液使吸光度值改变0.001为1个酶活力单位(U)。

1.3.3 pH值对POD活性的影响

用柠檬酸－磷酸盐缓冲液调整反应体系的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10)，在 25℃条件下测定 POD 活力，以酶活力最高值为100%，计算相对酶活，研究pH值对POD活性的影响。

1.3.4 温度对POD活性的影响

在最适pH条件下，调节反应体系温度(10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)按 1.3.2 酶活测定方法分别测定POD酶活力，以酶活力最高值为100%，计算相对酶活，研究温度对POD活性的影响。

1.3.5 POD的热稳定性

将 POD 酶液分别置于 60、70、80、90、100℃ 水浴中保温 5、10、15、20、25、30 min 后，迅速冷却，按1.3.2酶活测定方法测定POD残留活性。

1.3.6 不同浓度H2O2对POD活性的影响

在测定酶活力的反应体系中，调节H2O2浓度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)，研究不同浓度H2O2对POD活性的影响。

1.3.7 POD的底物专一性

分别以邻苯二酚、绿原酸、没食子酸、焦性没食子酸和愈创木酚为反应底物，研究不同酚类底物对POD活性的影响。根据Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，利用双倒数作图法，分别计算“鸡皮糙”山药POD对不同酚类底物的米氏常数Km和最大反应速率Vmax，底物亲和力大小用Vmax/Km表示［7］。

1.3.8 金属离子对POD活性的影响

在测定酶活力的反应体系中加入不同的金属离子至终浓度分别为1 mmol/L和10 mmol/L，按1.3.2酶活测定方法测定POD残留活性。研究不同金属离子对POD活性的影响。

1.3.9 不同抑制剂对POD活性的影响

在测定酶活力的反应体系中加入不同浓度的Vc、NaHSO3、L-半胱氨酸、草酸、EDAT-2Na、柠檬酸、植酸等抑制剂，按1.3.2酶活测定方法测定POD残留活性。研究不同抑制剂对POD活性的影响。

1.4 数据处理

实验数据为3次重复的平均值，利用SPSS19.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 pH值对POD活性的影响

如图1所示，当pH小于3.0时，随pH的升高，POD活性增加缓慢;pH大于3.0时，POD活性快速增加，当pH为4.0时POD活性达到最大;此后，随着pH的继续增加，其活性迅速下降，故“鸡皮糙”山药POD最适pH为4.0。当pH小于3时，80%以上的POD活性被抑制;pH大于8时，约有70%的POD活性被抑制。由此可知，在“鸡皮糙”山药加工过程中，可以将pH调节在其活力相对较低的范围内，从而有效控制POD引起的酶促褐变。

图1 pH对POD活性的影响

2.2 温度对POD活性的影响

如图2所示，在10～35℃范围内，随着温度的升高，POD酶活性逐渐升高，35℃时酶活性达到最大，随着温度的继续升高，酶活性又开始呈下降趋势，并且温度高于60℃时，POD活性急速下降。这说明“鸡皮糙”山药POD的最适温度为35℃，采用较高温度进行烫漂可以达到抑制POD活性的目的。“鸡皮糙”山药POD的最适温度与马铃薯、花菜 POD的不同［8］，表明不同种类果蔬POD的最适温度是有差异的。赵喜亭等人的研究指出，山药POD的最适温度为50℃［9］，本研究结果与之存在较大差异，这可能与山药的品种等因素有关。

图2 温度对POD活性的影响

2.3 POD的热稳定性

如图3所示，“鸡皮糙”山药POD的活性随加热时间的延长而降低，并且温度越高活性下降趋势越明显。60℃水浴处理5 min，POD残留酶活51%，处理30 min时仍有20%的残留酶活;80℃水浴处理5 min，POD残留酶活降至34.4%，处理30 min残留酶活仅为5.9%;当温度达到100℃时，处理5 min POD残留酶活仅为17.1%，处理20 min则可使POD完全失活。因此，生产加工过程中可采用沸水烫漂的方式抑制POD活性。

图3 POD的热稳定性

2.4 不同浓度H2O2对POD活性的影响

如图4所示，在0～10 mmol/L范围内，随着H2O2浓度的增加，POD活性迅速上升，当H2O2浓度达到10 mmol/L时POD活性最高，随着H2O2浓度的进一步增加，POD活性又出现下降趋势。有研究表明，在植物体内，POD的催化作用受H2O2浓度的影响，当H2O2达到一定浓度时，POD能够发挥较大的催化作用，而超过这一浓度后，POD 的活性就会降低［8，10］。本研究也证明了这一点。

图4 不同浓度H2O2对POD活性的影响

2.5 POD的底物专一性

根据Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，计算出“鸡皮糙”山药 POD 对不同酚类底物的Km和Vmax，采用Vmax/Km比值表示POD与底物亲和力的大小，比值越大表明亲和力就越大［7］。由表1可知，以绿原酸为底物时，其Km值最小、Vmax值最大，Vmax/Km比值最大。因此，绿原酸与“鸡皮糙”山药POD的亲和力最大。而以没食子酸为底物时，酶与底物基本无反应。根据Vmax/Km比值的大小，“鸡皮糙”山药POD与各底物亲和力小依次为:绿原酸＞愈创木酚＞焦性没食子酸＞邻苯二酚＞没食子酸。这与铁棍山药POD的底物亲和性研究结果不同［9］。由此可以看出，同一果蔬不同的品种，其POD最适底物也存在差异。

表1 “鸡皮糙”山药POD氧化不同酚类底物的动力学参数

2.6 金属离子对POD活性的影响

如图5所示，不同金属离子对“鸡皮糙”山药POD活性的影响存在很大差异。其中，Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+对POD有明显的激活作用，并且随浓度的增加激活作用增强;Na+具有一定的抑制作用;Mn2+、K+对 POD则具有明显的抑制作用;低浓度(1.0 mmol/L)的Zn2+、Cu2+对POD有激活作用，而高浓度(10 mmol/L)的Zn2+、Cu2+则有一定的抑制作用。

图5 金属离子对POD活性的影响

2.7 不同抑制剂对POD活性的影响

如图6所示，不同浓度的抑制剂对“鸡皮糙”山药POD活性均有不同程度的抑制作用，并且抑制作用随抑制剂浓度的增加而增强。其中，柠檬酸、EDTA-2Na和NaHSO3对POD活性的抑制作用较弱，浓度为10 mmol/L时仍有50%以上的残留酶活。植酸、草酸在低浓度范围内(0～1 mmol/L)对POD活性抑制作用不明显，当浓度大于1 mmol/L时其抑制效果显著增加。L-半胱氨酸和抗坏血酸对POD活性则有很好的抑制效果，在低浓度0.5 mmol/L时即可抑制50%的酶活性;当浓度为10 mmol/L时，POD残留活性分别为15.8%和4.3%。抗坏血酸对POD抑制效果较好的原因可能与其能将酶促反应中间产物醌还原有关［11］;而L-半胱氨酸对POD抑制效果较好的原因可能与其能和中间产物醌生成稳定的无色物质，而阻止了黑色素的生成有关［12］。

图6 不同抑制剂对POD活性的影响

3 结论

(1)“鸡皮糙”山药POD催化愈创木酚氧化反应的最适pH为4.0，最适温度为35℃，高温处理可有效抑制其活性。“鸡皮糙”山药POD与不同底物结合能力的强弱依次为:绿原酸＞愈创木酚＞焦性没食子酸＞邻苯二酚＞没食子酸，其中绿原酸为最适底物。

(2)Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+对“鸡皮糙”山药POD有明显的激活作用;Mn2+、K+对POD则具有明显的抑制作用;低浓度的Zn2+、Cu2+对POD有激活作用，而高浓度的Zn2+、Cu2+则有一定的抑制作用。抗坏血酸、L-半胱氨酸、植酸、草酸、柠檬酸、EDTA-2Na、NaHSO3等7种抑制剂对POD活性均有一定的抑制作用，其中，抗坏血酸、L-半胱氨酸抑制效果最好，而柠檬酸、EDTA-2Na及NaHSO3的抑制效果较差。

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