高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株*

冯芳，赵伟，孙姗姗

(山东福洋生物科技有限公司，山东德州，253100)

葡萄糖酸及其盐类广泛应用于食品、医药、化工、建筑等行业，其中葡萄糖酸钙是白色晶体或粉末，不仅能够预防钙缺乏症，促进牙齿和骨骼发育，还可治疗血钙含量过低引起的抽搐和镁中毒等疾病。作为营养药物，葡萄糖酸钙具有易溶解和吸收的特性，静脉注射或口服皆可，因此在临床中用途广泛［1－3］。

葡萄糖酸钙的制备普遍采用生物发酵法［4］，一般以黑曲霉作为生产菌种。葡萄糖酸钙用途广，市场需求量大，筛选高产菌种是提高其产量的关键。高通量筛选技术是20世纪80年代发展起来的目的菌种选育的新技术，具有微型、高效和低成本等优点，已广泛应用于菌种选育［5－7］。本文以经紫外线-LiCl复合诱变处理的黑曲霉为研究对象，建立高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌种的方法。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

实验原始菌种为黑曲霉，来自山东福洋生物科技有限公司研发中心实验室。

1.2 培养基

种子培养基(g/L):C6H12O6·H2O 264.0 g，CO(NH2)20.2 g，KH2PO40.64 g，玉米浆 7.2 g，CaCO310.0 g，pH 6.5 ～7.0。

发酵培养基(g/L):C6H12O6·H2O 330.0 g，CO(NH2)20.1 g，KH2PO40.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，玉米浆1.0 g，CaCO338.0 g，pH 6.5 ～7.0。

上述培养基均于115℃，灭菌30 min。

斜面培养基(g/L):C6H12O6·H2O 66.0 g，CO(NH2)20.2 g，KH2PO40.13 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，玉米浆1.0 g，CaCO35.0 g，琼脂20.0 g，pH 6.5 ～7.0。

培养基于121℃，灭菌20 min。

1.3 主要与仪器

DHZ-D大容量恒温振荡器，太仓市实验设备厂;MJX-160C型霉菌培养箱和YXOQ-LS-75S11立式蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SWCJ-2D型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;TDZ5-WS平板离心机，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国芬兰雷勃有限公司;LC-WS100高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.4 相关参数测定方法

1.4.1 致死率的计算

1.4.2 葡萄糖酸钙的测定方法

1.4.2.1 酶标板分光光度法

孔板发酵中葡萄糖酸钙含量的测定采用简化的分光光度法。葡萄糖酸根可以络合Cu2+形成蓝绿色的络合物，这种络合物在690 nm下有吸收，并且在一定范围内吸光值和葡萄糖酸根离子的浓度呈线性关系。

1.4.2.2 高效液相色谱法

色谱柱:Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:V(甲醇)∶V(磷酸)=1∶10(其中磷酸的体积分数为1%);进样体积20 μL;检测波长210 nm;流速1 mL/min;柱温25℃。

1.5 实验步骤

1.5.1 黑曲霉孢子悬浮液的制备

加10mL生理盐水，将斜面孢子洗下，转入带有玻璃珠的三角瓶中，38℃，150 r/min摇床中振荡30 min后，显微镜计数，调整孢子浓度为107个/mL，备用。

1.5.2 紫外诱变

将5 mL孢子悬液移入直径6 cm无菌平皿，于15 W 的紫外灯，距离约 30 cm 照射 1、2、3、4、5 min，暗光条件下，梯度稀释，吸取处理后的孢子悬浮液0.1 mL涂布平板，避光于霉菌培养箱38℃，培养3 d至长出成熟菌落，统计致死率，观察菌落形态。

1.5.3 紫外线-LiCl复合诱变

将5 mL孢子悬液倒入直径6 cm无菌平皿于15 W的紫外灯，距离约30 cm处照射2 min，加入不同浓度LiCl溶液0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，静置处理20～30 min，其他操作同1.5.2。

1.5.4 孔板培养

种子孔板和发酵均为48孔板，即A、B、……H×1、2、……6。种子孔板装液量为100 μL，孔 A1和 C4接入一定体积未诱变的孢子悬浮液，为对照孔，其余孔板接入处理后等体积的孢子悬浮液，于38℃，300 r/min的恒温摇床培养16 h。发酵孔板接装液量为700 μL，接种量为 10%，于 38℃，300 r/min 振荡培养36 h。利用酶标仪测定葡萄糖酸钙含量。

1.5.5 高通量检测流程

将发酵孔板于孔板离心机中3 000 r/min，离心30 min;取上清液50 μL加入空白孔板中，依次加入400 μL 0.1 mol/L CuSO4，550 μL 去离子水，于150 r/min的恒温摇床中振荡10 min后，沸水浴5 min，冰水迅速冷却至室温。

每孔移取取200 μL加入酶标板中，于 Thermo Multiskan MK3酶标仪中，检测其690 nm下的吸光值，计算葡萄糖酸钙含量。

1.5.6 摇瓶培养

由高通量筛选得到的葡萄糖酸钙高产菌种，为了保证其发酵稳定性，将其连续传代4次，每次传代后接入发酵培养基培养，测定发酵液中葡萄糖酸钙含量。

种子摇瓶装液量25 mL，38℃，300 r/min的恒温摇床中培养24 h;发酵摇瓶装液量50 mL，接种量10%，38℃，300 r/min的恒温摇床中培养36 h左右。高效液相法测定发酵中的葡萄糖酸钙含量，作为参考指标。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖酸钙高产菌株复合诱变条件的确定

2.1.1 紫外线最佳照射时间的选择

物理诱变剂有快中子、60Co、γ射线。高能电子流β射线和紫外线等，其中作用最普遍的是紫外线辐照［8］。微生物在经紫外线照射后，受到不同程度的损伤，从而导致DNA分子或染色体发生畸变，最终导致生物性状发生突变［9］。

从图1可以看出，随着紫外线照射时间的延长，孢子的致死率逐渐升高，辐照时间为5 min时，致死率已达到98%，接近100%。根据现代诱变育种理论，生产中性能稳定的菌株诱变致死率为70%～80%时，更易筛选得正突变率高的菌株［10］，因此紫外线最适照射时间为2 min。

图1 紫外线照射时间对孢子致死率的影响

2.1.2 LiCl诱变致死率及结果

葡萄糖酸钙是葡萄糖酸与碳酸钙中和反应生成的，而葡萄糖酸是黑曲霉的发酵代谢产物，它的合成过程复杂［11］。常规单一诱变处理不易得到高产菌株，复合诱变具有协同效应，比单因子诱变效果好，同时还可解除单因子诱变产生的“疲劳效应”［12－13］。

将孢子悬浮液于15 W的紫外灯距离约30 cm处照射 2 min 后，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%LiCl溶液静置处理20～30 min，平板涂布，LiCl溶液浓度与孢子诱变致死率的关系如图2所示，菌落形态特征如表1所示。

图2 LiCl溶液浓度对孢子致死率的影响

从图2可以看出，随着LiCl溶液浓度的升高，孢子的致死率呈上升趋势，根据诱变致死率70%～80%，诱变菌株的正突变率高的特性，LiCl溶液浓度为1%～1.5%较为适宜。

表1 LiCl诱变菌种的菌落形态特征结果

由表1可知，LiCl溶液浓度过低，诱变致死率低，诱变孢子悬浮液平板涂布生成的菌落过多，不易筛选单菌落;LiCl溶液浓度过高，孢子致死率接近100%。

根据菌落形态特征和诱变致死率的适宜范围，LiCl溶液浓度选为1.5%时，诱变致死率为80%，单菌落的透明圈较大，孢子黑且大，生长旺盛。

2.2 高产葡萄糖酸钙黑曲霉菌株的高通量筛选

2.2.1 孔板发酵安全性能验证

在同一孔板的发酵培养基中，交替接入相当于培养基体积10%黑曲霉的孢子悬液，在38℃下，转速300 r/min，培养40 h之后，吸取未接入孢子悬液的发酵培养基进行涂布，平板并未有黑曲霉菌落生成。检测结果说明接种孔相邻的空白孔无染菌污染现象，证明48孔板孔洞之间不存在交叉污染。

2.2.2 孔板与摇瓶发酵性能对比

按相同接种量接入孢子悬液于种子孔板和摇瓶中，在 38℃下，转速 300 r/min，培养 24h之后，以10%的接种量将孔板和摇瓶的种子液转入发酵孔板和摇瓶中，在相同条件下进行培养，48孔板与摇瓶发酵趋势对比关系如图3所示。

图3 48孔板与摇瓶发酵趋势对比关系

根据图3，在40 h左右，48孔板与摇瓶的发酵液中葡萄糖酸钙的含量不再升高，发酵基本结束。发酵初期，摇瓶的发酵速率较快，而30 h之后，48孔板发酵液中葡萄糖酸钙含量明显高于摇瓶，因为黑曲霉是好氧微生物，随着不断代谢生成葡萄糖酸钙，对溶氧要求高，48孔板的通氧量要优于摇瓶，更适合菌株发酵［15］。

结果证明，摇瓶发酵与孔板微型化发酵有良好的相关性，即孔板微型化发酵有一定可行性，可以用孔板代替摇瓶验证初筛菌种的发酵性能。

2.2.3 高产葡萄糖酸钙菌株的初步确定

将经紫外线-LiCl复合诱变处理的孢子悬浮液转入48孔板进行发酵试验，利用多功能酶标仪测定法发酵液中葡萄糖酸钙的含量，如表2所示，从12个48孔板中共筛选得到11个高产孔，发酵液中葡萄糖酸钙含量最高达到24.07 g/100 mL，比普通菌种高6.83 g/100 mL。

表2 葡萄糖酸钙高产菌株的筛选结果

2.3 高产葡萄糖酸钙菌株摇瓶复筛

将高通量筛选确定的葡萄糖酸钙高产孔的种子液进行平板涂布，挑单菌落划斜面，共得到48支斜面，经摇瓶复筛确定其中9支为高产菌株，传代后进一步检测其稳定性，其筛选结果如表3所示。

表3 高产葡萄糖酸钙菌株复筛结果

根据表3，菌株 P-2、P-9、P-26、P-27与未经诱变处理的原始菌种对比，斜面长势良好、产孢丰富，进行发酵试验，生成的葡萄糖酸钙含量高，产代后发酵性能稳定。而其余5株菌株传代后，均出现不同程度的发酵性能退化现象。

由于UV-LiCl复合诱变处理得到的高产菌株，变异的方向和性质难控制，易突变反复，需通过传代检测其发酵性能稳定性。得到的4支葡萄糖酸钙高产菌株，特别是菌株P-9，发酵液中葡萄糖酸钙含量最高达到23.04 g/100mL，与原始菌种对比，葡萄糖酸钙含量提高30%左右，效果明显。

3 结论

经紫外线-LiCl复合诱变处理的孢子悬浮液，转入48孔板进行发酵试验，通过高通量筛选得到4株葡萄糖酸钙高产菌株，将其连续传代4次，发酵性能稳定，特别是菌株P-9，发酵液中葡萄糖酸钙含量高达23.04g/100mL，与原始菌种相比，产量明显提高30%。

筛选得到葡萄糖酸钙高产菌株只是初步验证了其发酵稳定性，需要发酵中试进一步验证和优化，从而应用于车间生产。

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