蔷薇藻藻蓝蛋白的分离纯化及其体外抗氧化活性*

张艳燕，陈必链

1(龙岩出入境检验检疫局，福建 龙岩，364000)2(福建师范大学生命科学学院，福建福州，350108)3(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建福州，350108)

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)和隐藻(Cryptophyta)等藻类特有的一种水溶性捕获光能的蛋白，主要包括藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)3种。藻蓝蛋白是一种主要的捕光色素蛋白，具有荧光、抗癌、抗氧化和抗炎症特性，根据来源不同，藻蓝蛋白可以分为两种类型:R-PC和C-PC。不同类型的藻蓝蛋白，在氨基酸序列和光学性质等方面不尽相同。藻蓝蛋白鲜亮的蓝色是由于共价结合线性四吡咯辅基，通常又称为胆汁三烯。在所有的5种胆汁三烯色素中，有不同数量和排列的共轭双键。藻蓝蛋白的总分子质量一般为140～210 ku，含有α和β两个亚基，亚基分子量在15 ku至22 ku之间。藻蓝蛋白的晶体结构显示它含有一个类似于三聚体的构造，亚基间相互关联形成(αβ)原聚体，单体间借助连接多肽的作用再聚合成(αβ)3和(αβ)6，后者是藻胆蛋白体的功能单位［1］。藻蓝蛋白的α和β亚基均由载体蛋白(脱辅基蛋白)和发色团(色基，开环线性延展的四吡咯化合物)组成，色基通过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基交联，每个亚基有1～4分子发色基。

蔷薇藻(Rhodella reticulata)是属于红藻门的一种海洋单细胞红藻，富含藻蓝蛋白等生物活性物质。随着光强度的增大，蔷薇藻的生物量随之提高，而在同等条件下，藻胆蛋白的含量却减少［2］。该藻以硝酸钾为氮源，浓度为0.75 g/L的条件下生长最好，得到最大的藻蓝蛋白产量［3］。在蔷薇藻培养基中加入除草剂2，6-dichlorobenzonitrile(DCB)，将引起藻细胞发生抗DCB的自发突变。在稳定期加入DCB，不影响藻细胞数量但会抑制多糖的产量［4］。通过可控的水解方法检测到蔷薇藻多糖的糖基组成，它至少由10种单糖组成，含木糖、葡萄糖、半乳糖、甲基戊糖、甲基己糖、鼠李糖等［5］。本课题组比较经过不同处理的蔷薇藻胞外多糖的清除自由基和抗氧化能力，实验结果表明，无论是粗胞外多糖还是去蛋白的胞外多糖，其清除自由基和抗氧化能力均呈剂量效应［6］。通过超声波处理蔷薇藻，可不同程度地提高生物量、藻蓝蛋白、胞外多糖等含量［7］。本文论文主要研究蔷薇藻藻蓝蛋白分离纯化，以及不同纯度的藻蓝蛋白的抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 藻种

蔷薇藻(Rhodella reticulata)FACHB 742，购于中国科学院武汉水生生物研究所。

培养基及藻的培养:

KOCK液体培养基(g/L)中:KH2PO40.025、KNO30.75、MgSO4·7H2O 1.95、FeCt 0.002 5、NaCl 12.5、KCl 0.4、MgCl2·6H2O 1.25、CaCl2·2H2O 0.6、NaHCO30.1、ViB1225 μg/L、土壤浸出液 1 mL/L。

蔷薇藻的培养参照文献［4］的方法进行，培养至第8天收集藻粉。

1.2 蔷薇藻藻蓝蛋白分离纯化方法

称取5g蔷薇藻冻干粉加50 mL蒸馏水于冰箱中浸提过夜，充分浸提后于高速冷冻离心机，4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液。沉淀的藻泥加50 mL蒸馏水继续浸提过夜2次，合并3次浸提所得上清液为藻蓝蛋白粗提液，即粗蛋白，记为crude PC。粗提液加入固体硫酸铵至饱和度分别为0%、20%、40%和60%，静置过夜，高速冷冻离心机，4℃、12 000 r/min离心20 min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24 h，然后用0.01 mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)pH 7.0平衡透析24 h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，即为上样样品。将藻胆蛋白粗品上样于用0.01 mol/L PBS(pH 7.0)缓冲液平衡好的 DEAE-Sepharose FF柱，用0.125～0.50 mol/L NaCl作梯度洗脱，洗脱液总体积为500 mL，流速1.5 mL/min，每管收集约5 mL。将收集到的各管测其280 nm和620 nm处的光吸收值。根据吸收峰和OD620/OD280值，收集较纯的样品，记为 pure PC。将收集到的较纯的样品透析、浓缩、冻干后备用。

1.3 藻蓝蛋白的纯度鉴定

(1)藻蓝蛋白紫外可见光区光谱特性测定，利用752紫外光栅分光光度计对纯化的藻蓝蛋白样品在220～800 nm紫外-可见光区进行光谱扫描。

(2)SDS-PAGE电泳，将纯化的样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%，并用考马斯亮兰R-250染色，以检测样品的亚基组成及其分子量。

(3)藻蓝蛋白纯度的光学表示法，用藻蓝蛋白溶液在最大可见光吸收峰处的吸光值与蛋白质特征吸收峰的吸光值之比(ODmax/OD280)来表示。

1.4 藻蓝蛋白的氨基酸组成

用日立L8800高效氨基酸分析仪，天冬氨酸、苏氨酸等16种氨基酸依据GB/T 5009.124－2003食品中氨基酸的测定方法检测藻蓝蛋白的氨基酸含量(色氨酸检测采取6 mol/L NaOH进行碱水解)，并充入少量氮气，在酒精喷灯下迅速封管后置于110℃烘箱中水解22 h，取出冷却，过滤并浓缩，加蒸馏水溶解并定容至50 mL，即得待测样品溶液。

1.5 藻蓝蛋白体外抗氧化活性

抗羟自由基(·OH)能力的测定参照Smirnoff and Cumbes［8］方法，亚油酸自动氧化抑制试验(FOX化验)参照文献［9］的方法，抗超氧阴离子自由基·)能力和总抗氧化能力(T-AOC)的测定均采用试剂盒进行测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所，以Vc为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 蔷薇藻藻蓝蛋白的分离纯化

蔷薇藻的水溶性蛋白提取液经硫酸铵分级沉淀，结果见表1。

表1 硫酸铵饱和度对提取藻蓝蛋白的影响

由表1可知，当硫酸铵饱和度为40%时，藻蓝蛋白的纯度最高，OD620nm/OD280nm为1.156，远远高于其他饱和度的硫酸铵沉淀结果。因此，可选择饱和度为20%的硫酸铵去除蔷薇藻的杂蛋白，再用40%饱和度的硫酸铵沉淀目的蛋白即粗藻蓝蛋白。硫酸铵沉淀所得藻蓝蛋白粗品上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，从DEAE-Sepharose FF离子交换层析的洗脱图谱(图1)可以看出，在整个层析过程中280 nm处有3个吸收峰。第1个峰最大，为穿透峰，无色，是没有吸附上的杂蛋白。第2个峰较小，是用0.25 mol/L NaCl洗脱下来的蓝色的目的蛋白，即纯藻蓝蛋白，记为pure PC。最后出来的峰是用0.50 mol/L NaCl洗脱下来的一个蓝紫色蛋白峰，即别藻蓝蛋白。

图1 DEAE Sepharose FF离子交换洗脱图谱

2.2 藻蓝蛋白纯度鉴定

用紫外光栅分光光度计在220～800 nm检测经DEAE Sepharose FF离子交换层析后收集所得到的藻蓝蛋白，观察藻蓝蛋白在紫外和可见光谱区的吸收特性，结果见图2。

图2显示，蔷薇藻藻蓝蛋白在光谱的可见光区域显示很强的吸收值，在620 nm处有最大的吸收峰，并且是单一的吸收峰，说明通过经过离子交换柱层析后，已得到纯藻蓝蛋白。

图2 藻蓝蛋白紫外可见光吸收光谱图

将经过离子交换柱层析的样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%，电压为200 v，时间50 min，上样量为5 μL，并用考马斯亮兰R-250染色，以检测样品的亚基组成及其分子量，结果见图3。

图3 考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳图

由图3可见，SDS变性条件使藻蓝蛋白分离成两部分，泳道1清晰地呈现出两条染色带，分子量分别为18 ku和22 ku左右，说明蔷薇藻的藻蓝蛋白含有α和β两个亚基。这与文献所报道的α亚基的分子量在15～20 ku之间，β亚基的分子量在17～22 ku 间相符［10］。

蔷薇藻藻蓝蛋白经过粗提、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF离子交换柱层析等步骤的纯化，结果见表2。

藻蓝蛋白的纯度标准一般用OD620nm/OD280nm来表示，由表2可知，蔷薇藻藻蓝蛋白粗提液的纯度为0.422，经过2次硫酸铵沉淀，纯度上升为1.156，再经DEAE Sepharose FF柱层析后，纯度提高到3.92，已达到反应纯(reactive grade)［11］，但是收率下降很快，最后得到的总收率为19.45%。

表2 蔷薇藻藻蓝蛋白各级纯化结果

2.3 蔷薇藻藻蓝蛋白的氨基酸组成

取一定量的冻干的纯藻蓝蛋白，检测纯藻蓝蛋白的氨基酸组成及含量，结果见表3。

表3 蔷薇藻藻蓝蛋白的氨基酸组成

由表3可知，蔷薇藻藻蓝蛋白由17种氨基酸组成，氨基酸总含量为15.60%，其中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量较高，分别为 1.89%、1.64%、1.53%和1.48%。

2.4 蔷薇藻藻蓝蛋白体外抗氧化活性

不同浓度(0.03，0.06，0.12，0.24，0.48 mg/mL)的蔷薇藻粗藻蓝蛋白(crude PC)和纯藻蓝蛋白(pure PC)溶液对羟自由基的清除能力见图4，对亚油酸自动氧化的抑制率见图5，对超氧阴离子的清除能力见图6，总抗氧化能力见图7。

由图4可见，蔷薇藻藻蓝蛋白对羟自由基·OH表现出较高的清除能力，在试验所选的浓度范围内，藻蓝蛋白的浓度与清除率呈现出量效关系，且纯藻蓝蛋白的清除率高于粗藻蓝蛋白，高于同浓度下的Vc对照组的清除率。

图5 粗PC和纯PC对亚油酸自动氧化的抑制率

由图5可知，在FOX实验中，藻蓝蛋白以剂量依赖方式抑制氧化性损伤，并且纯化后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白在同等浓度下抑制率更高。当藻蓝蛋白浓度为0.48 mg/mL时，蔷薇藻粗藻蓝蛋白和纯化后的藻蓝蛋白对亚油酸自动氧化的抑制率分别为59.37%和70.58%。

图6 粗PC和纯PC对超氧阴离子的清除率

如图6所示，蔷薇藻藻蓝蛋白对超氧阴离子具有较强的清除作用，且纯化后的藻蓝蛋白的清除效果更好。当纯藻蓝蛋白的浓度为0.48 mg/mL时，其清除超氧阴离子自由基的活力为618.89 U/L，远高于对照组，可见蔷薇藻藻蓝蛋白有很好的抗超氧能力。

图7 粗PC和纯PC的总抗氧化能力

由图7可知，蔷薇藻纯化后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白具有更高的总抗氧化能力，且呈剂量依赖效应。当藻蓝蛋白浓度为0.48 mg/mL时，其总抗氧化能力分别为5.22和8.13 U/mL。

3 讨论

反复冻融是一种温和的非变性条件下提取藻胆蛋白的有效方法，通过两步硫酸铵沉淀能有效地去除杂蛋白，同时获得高浓度的藻蓝蛋白。硫酸铵作为沉淀试剂，它能使蛋白保持完整性，并能快速沉淀藻胆蛋白，从而减少操作过程中样品量的损失，硫酸铵在低温下具有高水溶性并且还有抑菌作用，这些特性都有助于蛋白的分离纯化。本实验用两步分级沉淀:初始的20%饱和度沉淀除藻胆蛋白以外的杂蛋白，然后用40%饱和度的硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。经过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析后，得到纯度为3.92的纯藻蓝蛋白，这个值可与前人所报道的关于藻蓝蛋白纯化相当［12－13］，经两步硫酸铵沉淀和DE 52过柱后，纯化后的螺旋藻藻蓝蛋白其吸光度比值(A620/A280)为4.69［14］。蔷薇藻纯化后的藻蓝蛋白在620 nm处有唯一的吸收峰，这符合藻蓝蛋白本身所具有的独特性质，Soni等［12］报道藻蓝蛋白的最大吸收峰在610～620 nm之间。

SDS-PAGE电泳用考马斯亮蓝染色，结果得到两条明显的条带，说明藻蓝蛋白含有两个亚基，且α亚基的分子量为18 ku，β亚基的分子质量为22 ku，这与前人报道的α亚基的分子质量在15～20 ku之间，β亚基的分子质量在17～22 ku间相符［10］。Sarada［14］等报道螺旋藻的两个亚基分子质量分别为19 ku和 20 ku。Minkova等［15］用紫外可见光谱法及SDS-PAGE证明螺旋藻藻蓝蛋白的纯度，Madhyastha等［16］也是用以上方法鉴定螺旋藻藻蓝蛋白的纯度。

海藻跟一般的蔬菜相比，就必需氨基酸的含量来说是相当的，含有几乎一半的必需氨基酸，而且其蛋白质剖析图与鸡蛋蛋白质的剖析图非常相近［17］。蔷薇藻的藻蓝蛋白含有17种氨基酸，其中以天冬氨酸和谷氨酸含量最高，含量分别为12.12%和10.51%。欧瑜等［18］从盐生隐杆藻中分离得到藻蓝蛋白，测得藻蓝蛋白的17种氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高。螺旋藻的藻蓝蛋白中的氨基酸也以Asp和Glu最高，含量分别为12.8%和13.5%［19］。

自由基，如羟基(·OH)、超氧自由基(O2－·)、过氧化氢自由基(ROO·)等，都产生于有氧代谢［20］。自由基反应，特别是参加氧化作用的自由基，与许多生理过程有关，比如破坏脂类、蛋白质、细胞膜、核酸，最后导致许多疾病［21］。Benedetti等［22］从 Aphanizom-enon flos-aquae提取的藻蓝蛋白具有抗氧化活性，在体外能保护人类红细胞和血浆样品抗击氧化损伤。Estrada等［23］从螺旋藻提取的藻蓝蛋白可以很好地清除羟基氢氧基和过氧化氢自由基，阻止微粒体脂质过氧化，并发现成剂量依赖效应。同样的实验结果也出现在小球藻蛋白［24］、鱼腥藻的藻蓝蛋白［25］和龙须菜的藻胆蛋白［26］。杨立红等［25］在对鱼腥藻藻蓝蛋白的研究中发现，纯化后的蛋白比粗蛋白的抗超氧能力更高，且呈现一定的剂量关系。超氧阴离子自由基是体内主要的活性氧，是生成有害活性氧的源头，在细胞中通过单电子还原产生的O－2·，来自线粒体、微粒体、浆膜和胞浆的酶系统和非酶系统。龙须菜的藻胆蛋白具有良好的抗超氧阴离子能力，并随着蛋白含量升高而增加［26］。

蔷薇藻纯化后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白具有更高的总抗氧化能力，且呈剂量依赖效应。这与Estrada等［22］在对螺旋藻的抗氧化研究中得到的结果相一致。鱼腥藻纯蛋白的总抗氧化能力高于粗蛋白［25］，Pinero 等［23］发现螺旋藻藻胆蛋白中藻蓝蛋白的抗氧化活性最强，其抗氧化活性随纯度的增加而增大。在光照条件下，藻胆蛋白能够产生自由基，而在黑暗中，则能够清除自由基，显示藻胆蛋白有产生和清除自由基的双重功能［27］。

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