20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜树碱酯类化合物的合成及其抗肿瘤活性

高 鹏， 朱 磊， 王佳乐， 王浦海， 孙 立， 袁胜涛

(1. 南京工业大学 a. 药学院； b. 江苏省药物研究所，江苏 南京 211816； 2. 中国药科大学 国家南京新药筛选中心，江苏 南京 211009)

喜树碱(1)是由Wall等[1]于1966年首次从珙桐科植物喜树中分离得到的一种具有很强抗肿瘤活性的生物碱。构效关系研究表明[2～4]，1分子中E环内酯环结构的完整性与其抗肿瘤活性密切相关，其内酯结构是抑制拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)的重要基团。1在体内存在着闭环的内酯形式和开环的羧酸盐形式之间的平衡，而在生理pH条件下，1极易由内酯环形式开环为羧酸盐形式。人血浆白蛋白优先与1的羧酸盐形式结合，形成稳定的复合物，使平衡向开环的羧酸盐形式移动，导致体内具有抗肿瘤活性的内酯环含量很低，毒副作用增大。1分子中存在1个分子内氢键，它不仅活化了内酯环也削弱了羟基和酶的相互作用[5，6]。如果将1的20-位羟基酯化，势必消除1分子内氢键，增加邻近羰基的位阻，降低羰基的活性，使亲核试剂不易进攻羰基，从而可减缓内酯环在体内的开环，有利1发挥抗肿瘤作用。

研究发现[7，8]，在1的7-位引入亲脂性基团可以提高其脂溶性，增加稳定性，延长药物在体内代谢时间，从而减少给药量，降低药物对人体的伤害，增加抗肿瘤活性。Tanizawa等[9]发现7-乙基在稳定喜树碱衍生物与DNA-TopoⅠ复合物的相互反应中起着重要的作用。我们设想将1的20-位羟基酯化和7-位乙基化同时引入喜树碱衍生物中，以期使两者的协同作用来进一步增加疗效，降低毒副作用。

本文以1和正丙醛为原料，在冰醋酸-硫酸体系中以H2O2-FeSO4为自由基引发剂经自由基烷基化反应制得7-乙基喜树碱(2)[10]；以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)为脱水剂，2在DMAP催化下与取代苯甲酸(3a～3k)直接酯化[11]，合成了11个新型的20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜树碱酯类化合物(4a～4k， Scheme 1)，其结构经1H NMR， IR和ESI-MS表征。初步测定了4a～4k对人肺癌细胞(LLC-E9FP)，人肺腺癌细胞(95D)，人胃癌细胞(BGC-803)，人胃癌细胞(HGC-27)和人肝癌细胞(7721)的增殖抑制活性。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-4型数字显示显微熔点仪(温度未校正)；AVANED AV-500型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Nicolet IS 10型傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片)；Waters Q-TOF MicroTM型质谱仪；EssentiaLC-15C型高效液相色谱仪[Luna十八烷基硅胶柱，流动相：V(甲醇) ∶V(水)=80 ∶20， 267 nm)。

CompabcdefghijkR1HHHHHHNO2NO2HHCF3R2HFClBrINO2HHCNCF3HR3HHHHHHHNO2HHH

Scheme1

1，成都澜绮制药有限公司；EDCI和DMAP，苏州昊帆生物科技有限公司；其余所用试剂均为分析纯，其中CH2Cl2经CaH2回流干燥处理，丙醛用前重蒸。

1.2 合成

(1)2的合成

将13.00 g(8.6 mmol)溶于冰醋酸(80 mL)中，于5 ℃～10 ℃缓慢滴加98%硫酸20 mL，滴毕，搅拌至亮黄色得溶液A。

在三口烧瓶中加入FeSO4·7H2O 2.50 g(9 mmol)和去离子100 mL，搅拌使其溶解；于2 ℃左右加入溶液A，搅拌均匀后滴加正丙醛3.00 mL(40 mmol)，滴毕，待体系温度降至2 ℃左右时缓慢滴加30%H2O22.40 mL(15 min);反应45 min。倾入250 mL冰水中，静置1.0 h，过滤，滤液用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，减压浓缩至干得黄色固体。经硅胶(100目～200目)柱层析(洗脱剂:氯仿)纯化得淡黄色粉末22.40 g，纯度99.0%(HPLC，下同)，收率74.0%， m.p.259 ℃～260 ℃(259 ℃～261 ℃[12])；1H NMRδ: 1.04(t,J=7.3 Hz, 3H, 19-CH3), 1.42(t,J=7.5 Hz, 3H, 30-CH3), 1.88(m, 2H, 18-CH2), 3.22(q, 2H, 29-CH2), 3.80(s, 1H, 20-OH), 5.29(s, 2H, 5-CH2), 5.30(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 5.75(d,J=16.6 Hz, 1H, 17-CH2), 7.68(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-CH), 7.71(s, 1H, 14-CH), 7.81(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-CH), 8.13(d,J=8.5 Hz, 1H, 9-CH), 8.26(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-CH)； IRν： 3 373, 1 757, 1 658, 1 607, 1 155 cm-1。

(2) 4的合成(以4a为例)

在三口烧瓶中加入苯甲酸(3a)0.73 g(6 mmol)的CH2Cl2(100 mL)溶液，冰浴(2 ℃)冷却下搅拌均匀；依次加入20.75 g(2 mmol)， EDCI 1.53 g(8 mmol)及DMAP 1.47 g(12 mmol)，避光搅拌15 min。拆去冰浴，升至室温，避光反应2.0 h(淡黄色澄清溶液)。倾入100 mL冰水中洗涤，分液，有机层依次用稀酸(pH=3.3)，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压浓缩至1/10体积后经硅胶柱层析[梯度洗脱剂：V(CH2Cl2) ∶V(THF)=100 ∶0～95 ∶5]纯化得类白色粉末，用CH2Cl2/MeOH重结晶得4a0.62 g，纯度99.0%，收率64.4%。

用类似的方法合成4b～4k。

1.3 抗肿瘤活性测试[13，14]

取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数(2～4)×104个·mL-1，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180 μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24 h。换液，加入受试药物，20 μL/孔，培养72 h。将MTT试剂加入96孔板中，20 μL/孔，培养箱中反应4 h。吸去上清液，加入DMSO， 150 μL/孔，平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每孔的吸光值(OD)，重复试验3次取平均值计算肿瘤细胞抑制率{抑制率=[(OD对照-OD药敏)/OD对照]×100%}。

2 结果与讨论

2．1 合成

在2的合成中，1溶解性差，需在冰醋酸中加入98%硫酸助溶，提供H+与喹啉环上的氮原子结合形成铵盐，增强1的溶解性，最佳的比例为V(冰醋酸) ∶V(浓硫酸)=4 ∶1，即能形成均相溶液又不至于酸过量引发大量副反应。H2O2作为亲核试剂进攻醛基，在FeSO4·7H2O的引发和H2O2存在下生成酰基自由基，H2O2过量易引发副反应，FeSO4·7H2O过量则使最终产物颜色加深，最佳的n(FeSO4·7H2O) ∶n(H2O2)=3 ∶1。

在4的合成中，考虑到该反应的空间位阻，采取了亚胺催化进行缩合。先采用二环己基碳二亚胺(DCC)/DMAP体系，发现整个反应的进程很缓慢，平均反应时间在12 h以上，推测可能是DCC的亚胺两端所连基团位阻较大不易与苯甲酸的羟基结合所致。改用位阻较小的EDCI后，反应速率明显提高。使用催化量的DMAP时，反应产率不高(25%)且时间长(6 h左右)，当增加DMAP用量时反应明显加快且收率提高，当n(2) ∶n(3) ∶n(EDCI) ∶n(DMAP) =1 ∶3 ∶4 ∶6时，反应基本在2 h左右完成且收率稳定(>65%)；同时，实验还发现3上的基团对反应收率亦有影响，当苯甲酸上的取代基为强吸电子基团时，苯甲酸与EDCI形成中间态的羰基正电性增强有利于2的20-位羟基的亲核取代的发生，如-NO2， -CF3存在时总收率能达到80%以上。

合成4的实验结果见表1，表征数据见表2。

表1 合成4的实验结果Table1 Experimental results of synthesizing 4

表2 4的1H NMR和IR数据Table 2 1H NMR and IR data of 4

续表2

Comp.1H NMR δ(J/Hz)IR ν/cm-14h1.13(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.39～2.53(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.29(s, 2H, 5-H), 5.49(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.79(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.65(t, J=9.8, 1H, 10-H), 7.75(q, 1H, 11-H), 8.10(t, J=9.8, 2H, 9,12-H), 8.40(d, J=7.5, 1H, 24-H), 8.46(m, 1H, 26-H), 8.93(s, 1H, 28-H)3 166, 2 972, 2 942, 2 881, 1 772, 1 742, 1 661, 1 605, 1 544, 1 345, 1 277, 1 165, 1 077, 762, 7204i1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.33～2.45(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.28(d, J=17.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.22(s, 1H, 14-H), 7.67(t, J=7.8, 1H, 10-H), 7.78(t, J=8.0, 3H, 11,25,27-H), 8.11～8.20(m, 4H, 9,12,24,28-H)3 604, 2 978, 2 940, 2 880, 2 231, 1 757, 1 734, 1 667, 1 618, 1 453, 1 277, 1 155, 1 102, 858, 765, 7084j1.10(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.34～2.47(m, 2H, 18-H), 3.21(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.64(t, J=7.5, 1H, 10-H), 7.78(q, 3H, 11,25,27-H), 8.14(q, 2H, 9,12-H), 8.22(d, J=8.0, 2H, 24,28-H)2 975, 2 938, 2 882, 1 760, 1 732, 1 665, 1 613, 1 326, 1 276, 1 160, 1 130, 1 100, 1 065, 860, 766, 7034k1.09(t, J=7.5, 3H, 19-H), 1.40(t, J=7.8, 3H, 30-H), 2.35～2.49(m, 2H, 18-H), 3.20(q, 2H, 29-H), 5.24(d, J=18.5, 1H, 5-H), 5.29(d, J=19.0, 1H, 5-H), 5.47(d, J=17.0, 1H, 17-H), 5.78(d, J=17.0, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H), 7.62～7.79(m, 2H,10,25-H), 7.77(t, J=8.0, 1H, 11-H), 7.88(d, J=7.5, 1H, 26-H), 8.12(d, J=8.0, 1H,9-H), 8.16(d, J=8.5, 1H, 24-H), 8.29(d, J=8.0, 1H, 12-H), 8.36(s, 1H, 28-H)3 499, 2 980, 2 941, 2 882, 1 763, 1 729, 1 664, 1 613, 1 454, 1 337, 1 254, 1 122, 1 070, 975, 825, 759, 696

2.2 抗肿瘤活性

4的抗肿瘤活性结果见表3。由表3可见，4b和4e对LLC-E9EP的抑制率都超过了喜树碱母核；4h， 4j和4k对95D也有明显的抑制作用(抑制率分别为55.03%， 49.09%和48.51%)；但4a～4k对BGC-803的抑制作用较弱；对HGC-27， 4j有比较明显的抑制作用(抑制率48.12%)；4d,4h和4k对7721有较为明显的抑制活性(抑制率分别为45.98%, 44.99%和49.13%)。

由体外活性筛选的初步结果可以看出：喜树碱的7-位乙基化和20-位取代苯甲酸酯化对喜树碱抗肿瘤活性的提升起了积极作用；同时可以推测此类化合物的活性差异可能是由取代苯甲酸的取代基决定：当取代基为强吸电子基团时表现为较好的抗肿瘤活性；当取代基为卤素时对LLC-E9FP抗肿瘤活性明显增强；没有取代基时大多无活性。由于此类化合物具有较好的体外抗肿瘤活性，其体内抗肿瘤活性实验正在进行中。

表3 4对肿瘤细胞的抑制率*Table 3 Inhibition rates of 4to cancer cells

*c=1．0×10-6mol·L-1； LLC-E9FP：人肺癌细胞； 95D：人肺腺癌细胞； BGC-803：人胃癌细胞； HGC-27：人胃癌细胞； 7721：人肝癌细胞

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