Lipozyme TL IM催化合成Temsirolimus

万振江， 卢晓霞

(中国科学院 成都生物研究所 天然产物研究中心,四川 成都 610041)

西罗莫司(3)又名雷帕霉素，是加拿大Wyeth Ayerst研究所于20世纪70年代初从放线菌吸水链霉菌培养液中分离出来的31元大环内酯类抗生素。研究初期表明3只具有弱的抗菌作用。近年研究表明，3在预防同种异体肾移植术后排斥反应、各种支架管置入导致的血管再狭窄及抗肿瘤等方面具有重要作用[1～3]。

Temsirolimus(5， Chart 1)是3的42-位丙酸酯类衍生物，为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂类药物，是此类药物中首个申请用于治疗癌症的产品。与α-干扰素疗法相比，5可将癌症的中位生存期延长3～6个月，因此该药物具有极高的市场价值。

Chart 1

Scheme 1

由于3分子结构中有两个二级醇羟基，对42-位醇羟基进行酯化反应时，往往得到3的42-位和31-位碳类衍生物。5的化学合成[4]方法一般都采用三甲基硅基对3的42-位和31-位醇羟基进行保护，然后选择性在42-位脱保护，生成42-位为游离羟基的中间体，再与酯化剂反应后去保护得到5。该方法反应复杂，需要经过保护脱保护等过程,步骤较多，并且产率较低。

脂肪酶全称为甘油三酰酯水解酶，广泛存在于动植物和微生物中，能够催化化合物的水解、醇解、酯化和酯交换等，具有较高的催化活性和稳定性，易于生产，也有较好的专一性[5～7]。2005年，Gu等[8]利用Lipase PS-C“Amano”Ⅱ成功地催化合成了5。 Lipase PS-C “Amano”Ⅱ催化速率较快，产率较高，但价格昂贵。此外该反应所用酯化剂为烯基酯，合成时需要贵重金属Pd试剂进行催化，反应条件严格，成本较高。

本文在文献[8]方法的基础，通过对几种脂肪酶(猪胰蛋白酶，胃蛋白酶，Novozyme 435， Lipozyme TL IM和PS IM Amano)的筛选，发现商品脂肪酶Lipozyme TL IM为催化剂，2,2,5-三甲基-1,3-二氧六环-5-羧酸酐(2)为酯化剂，对3进行酯化反应时，能够高度区域选择性得到3的42-位丙酸酯类衍生物4(产率90%)； 4水解后得到5(Scheme 1)，总产率83.7%，远远高于传统的化学合成方法。

该方法反应专一性强，条件温和，副产物少，非常经济且利于生产规模的扩大，为Temsirolimus的合成提供了一种方便而有效的方法。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Advance Bruker 600 MHz/300 MHz型核磁共振仪(DMSO为溶剂，TMS为内标)；Polaris Q型质谱仪。

柱层析用硅胶300目～400目和HSGF254 高效薄层层析硅胶板，青岛海洋化工厂生产；脂肪酶Lipozyme TL IM，丹麦诺维信酶制剂公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 2,2,5-三甲基-1,3-二氧六环-5-羧酸酐(2)的合成

在反应瓶中依次加入2,2-二羟甲基丙酸10．0 g(74.55 mmol)， 2,2-二甲氧基丙烷13.8 mL(111.83 mmol)，对甲苯磺酸(TsOH)0.71 g(3.73 mmol)和丙酮50 mL，搅拌下于室温反应2 h(TLC监测)。用混合溶剂[V(NH3) ∶V(EtOH)=1 ∶1]1．0 mL中和剩余的TsOH，减压蒸除溶剂,残余物用二氯甲烷250 mL溶解后用水(40 mL)洗涤，无水MgSO4干燥，减压蒸除溶剂得白色固体2，2，5-三甲基-5-羧酸(1)11.7 g，收率90%， m.p.120 ℃；1H NMRδ： 3.99(d,J=11.5 Hz, 2H， CH2), 3.54(d,J=11.5 Hz, 2H， CH2), 1.33, 1.25(s, 6H, CH3), 1.06(s, 3H, CH3)。

将1 5.0 g(28.7 mmol)用二氯甲烷(20 mL)溶解，搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)2.96 g(14.4 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，产生白色固体，于室温反应4 h。过滤，滤液减压蒸馏，粗品用少量乙酸乙酯溶解；过滤，滤液减压蒸除溶剂得无色液体34.75 g，收率81%；1H NMR(CDCl3)δ： 1.21(s, 6H, CH3), 1.36(s, 6H, CH3), 1.41(s, 6H, CH3), 3.66(d,J=12.0 Hz, 4H， CH2O), 4.18(d,J=12.0 Hz, 4H， CH2O)；13C NMR(CDCl3)δ： 17.83, 21.75, 25.72, 43.83, 65.85, 98.56, 169.68。

(2) 4的合成

在反应瓶中加入3 1.0 g(1.1 mmol)， 2 0.34 g(1.1 mmol)和无水叔丁基甲基醚(TBME)20 mL，搅拌下于室温加入Lipozyme TL IM 1 g，缓慢搅拌反应12 h(TLC监测)。过滤，滤液减压除溶得淡黄色固体4，产率40%；1H NMRδ： 4.5(m, 1H, 42-H), 4.0(m, 4H), 3.6(m, 2H), 1.34(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.06(s, 3H)。

(3) 5的合成

在反应瓶中加入4 0.5 g(0.47 mmol)和THF 5 mL，搅拌使其溶解；于0 ℃～5 ℃缓慢滴加2 mol·L-1硫酸2.5 mL，滴毕，于室温反应48 h(TLC监测)。用乙酸乙酯(3×15 mL)萃取，合并萃取液，用无水MgSO4干燥，减压蒸除溶剂，粗品用少量二氯甲烷溶解后经硅胶柱层析[洗脱剂:V(正己烷) ∶V(丙酮)=2 ∶1]分离得白色固体5 0.45 g，收率93%；1H NMRδ： 4.5(m, 1H, 42-H), 3.4(s, 4H), 1.04(s, 3H)； HR-ESI-MSm/z： Calcd for C56H87NO16Na{[M+Na]+} 1 052.591 7, found 1 052.588 6。

2 结果与讨论

脂肪酶的种类很多，催化性能也各不相同。以TBME为溶剂,在室温条件下，考察了五种脂肪酶催化3与2的酯化反应，结果见表1。从表1可见，Lipozyme TL IM的催化效果最好，产率达40%。与Lipase PS-C “Amano”Ⅱ相比， Lipozyme TL IM价格便宜，且易得。该方法更加简单容易，并且反应产物不需要进行柱层析纯化，经过简单的过滤就可直接进行下一步反应。且酯化剂2的合成简单方便，只需用DCC进行缩合就能得到。

以Lipozyme TL IM为催化剂，对酯化反应条件进行了筛选，结果见表2。由表2可见，最佳酯化反应条件为： 3 1 g(1.1 mmol), TBME 20 mL， Lipozyme TL IM用量为3质量分数的100%(1 g)，n(3) ∶n(2)=1 ∶4,于40 ℃反应48 h， 4的产率达90%。

表1 脂肪酶对3酯化反应的影响*
Table1Effect of lipase on esterification of3

催化剂产率/%催化剂产率/%猪胰蛋白酶5Lipozyme TL IM40胃蛋白酶5PS IM Amano18Novozyme 43525

*3 1．0 g,催化剂1．0 g, TBME 20 mL, 2 1.0 eq, 于20 ℃反应12 h

表2 酯化反应条件筛选*
Table2 Selection of esterification reaction conditions

催化剂/g2/eq温度/℃时间/h产率/%1.012012391.013012671.014012781.025012700.514012651.014012782.014012791.024012811.045012831.064012821.044024841.044048901.04407287

*3 1 g, TBME 20 mL，其余反应条件同1．2(2)

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