左归丸对去卵巢大鼠股骨中Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

王艳杰 任艳玲 宋 囡 李亚玲 吕海波 赵金茹 (辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110032)

左归丸对去卵巢大鼠股骨中Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

王艳杰 任艳玲 宋 囡 李亚玲 吕海波 赵金茹 (辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110032)

目的 观察左归丸对去卵巢骨质疏松(OP)模型大鼠股骨中Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，探讨左归丸对OP的防治作用机制。方法

SPF级4.5月龄SD雌性大鼠，分为三组：正常组39只;假手术组39只;200只采取双侧背部卵巢切除术进行绝经后OP造模。造模21 d后，将去卵巢大鼠随机分为5组：模型组、尼尔雌醇组、左归丸高剂量组、左归丸中剂量组、左归丸低剂量组，每组40只。然后开始灌胃给药，左归丸高、中、低剂量组分别给予ig6.4，3.2，1.6 g/kg剂量的左归丸混悬液灌胃;尼尔雌醇组灌服尼尔雌醇混悬液灌胃;正常组、假手术组和模型组均灌服蒸馏水。于连续给药60、120、180 d后分3批取材，取大鼠左后肢股骨近端1/3部分，采用RT-PCR方法检测骨组织中Ⅰ型胶原mRNA的表达水平。结果 去卵巢后，与正常组比较，模型组大鼠股骨中Ⅰ型胶原 mRNA水平明显降低(P＜0.01);和模型组比较，给药60d、120、180 d的左归丸各剂量组，股骨中Ⅰ型胶原mRNA水平显著升高(P＜0.01或P＜0.05)。结论 骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达水平的下调可能是绝经后骨质疏松(PMOP)发生的重要机制之一，左归丸能够上调骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达，从而有效防治OP。

左归丸;骨质疏松症;Ⅰ型胶原

绝经后骨质疏松(PMOP)是女性绝经以后，随着循环中雌激素水平的降低而出现的以全身性骨量减少和骨组织微细结构破坏为特征，继而导致骨脆性增加，骨折危险性增高的骨骼疾病。中医学中无(OP)此病名，但依据其病因病机及临床表现，将其归为“骨痿”范畴。中医认为肾藏精，主骨生髓，骨骼的生长、发育及修复均有赖于肾中精气的滋养和推动，故肾虚是绝经后OP发病的主要原因。左归丸出自张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补肾填精的名方。本实验采取去卵巢造模方法建立大鼠PMOP模型，以肾虚为PMOP的主要发病原因出发，研究左归丸对PMOP大鼠股骨中Ⅰ型胶原mRNA水平的影响，为临床防治PMOP提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物

SPF级 SD雌性大鼠280只，4.5月龄，体重270～290 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供〔许可证号：SCXK(沪)2008-0016〕。适应性喂养1 w，室温20℃ ～25℃，湿度20% ～30%，自由摄食、饮水，饲料为全价颗粒饲料(Ca：0.5%)。

1.2 实验药品及主要试剂

硫酸庆大霉素注射液(郑州羚锐制药股份有限公司，批号：0811121);左归丸中成药(上海雷允上封浜制药有限公司，批号：090409);尼尔雌醇片〔上海医药(集团)有限公司新华联〕;TMPlus试剂盒，TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒〔宝生物工程(大连)有限公司〕;SuperBuffer-2超快核酸电泳液，DNA电泳分子量标准(北京天恩泽基因科技有限公司);Gene Finder核酸染料，6×Loading Buffer DNA染料(厦门百维信生物科技有限公司)。

1.3 主要仪器及设备

TU-1810PC型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Heal Fore Neofuge13台式高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司);Mycycler TM Thermal Cycler PCR扩增仪(美国BIO-RAD);EPS 300天能电泳仪(上海天能科技有限公司);WD-9413B凝胶成像分析仪(北京六一仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将实验大鼠按体重随机分层，每层按数量比暂分为三组：正常组40只;假手术组40只;其余200只实施双侧卵巢切除术造模。造模21 d后，将存活大鼠随机分为5组：模型组、尼尔雌醇组、左归丸高剂量组、左归丸中剂量组、左归丸低剂量组每组39只。

1.4.2 造模方法 大鼠经10%的水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，由大鼠背部脊柱两侧入路完整摘除卵巢后，滴入10%的硫酸庆大霉素(0.4万U)0.5 ml，以防感染，之后将脂肪团放回腹腔，用同样方法摘除另一侧卵巢;假手术组仅将卵巢从腹腔提出而不切除，仅切除卵巢周围少量脂肪组织，逐层缝合伤口，用碘伏棉球消毒。以上手术操作均在无菌环境下进行。术后每只大鼠腹腔注射10%硫酸庆大霉素(0.4万U)1 ml/d，连续注射6 d后停药，之后若有呼吸异常者，则给予单笼隔离饲养，早晚分别给予腹腔注射10%硫酸庆大霉素(0.4万U)1 ml/次。

1.4.3 给药方法及剂量 造模21 d后，除正常组、假手术组和模型组外进行药物治疗，根据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸的等临床剂量为1.6 g/kg体重，并设为低剂量组。左归丸高、中、低剂量组大鼠分别给予左归丸 6.4、3.2、1.6 g/kg，1次/d;尼尔雌醇组给予尼尔雌醇 0.21 mg/kg，1次/w;使用前分别将左归丸和尼尔雌醇片用蒸馏水制成混悬液，定溶至所需浓度，10 ml/kg，灌服;尼尔雌醇组未灌药期间均灌服蒸馏水，10 ml/kg，1次/d;正常组、假手术组、模型空白组均灌服蒸馏水，10 ml/kg体重，1次/d;每周给予称重1次，并根据体重调整给药量。

1.4.4 标本采集 实验大鼠连续给药60、120、180 d后分三次取材，取材前所有大鼠禁食、禁水24 h。大鼠经10%的水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。取大鼠左后肢股骨近端1/3部分，剔除软组织及筋膜，用DEPC水处理过的铝箔纸包裹好，做好标记，迅速置入液氮中速冻，之后放入-70℃冰箱保存，以备RT-PCR方法检测骨组织中Ⅰ型胶原mRNA的表达。

1.4.5 RT-PCR测定大鼠骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达水平 用液氮充分预冷研钵，迅速将股骨放入预冷的研钵中，用研杵研磨骨组织，直至骨组织被研磨成白色粉末;向研钵中加入2 ml的RNAiso TM Plus，将白色粉末完全覆盖，室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状;将匀浆液转移至离心管中，每管大约1 ml，室温静置5 min;离心;吸取上清液，移入新的离心管中;加入 200 μl氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min;离心;吸取上层水相至另一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10 min;离心10 min，小心弃去上清，加入75%的乙醇1 ml，上下颠倒洗涤RNA沉淀，离心5 min后小心弃去乙醇;室温干燥沉淀2～5 min，之后加入适量的DEPC水(30～60 μl/管)溶解沉淀，-80℃保存。用紫外分光光度计测定 260、280 nm下的吸光度，并计算 OD260/OD280，取在1.8～2.2之间样品进行实验;根据RT-PCR试剂盒说明配制包含MgCl2、10×RT缓冲液、dNTP混合物、RNase抑制剂、Oligo dT、逆转录酶等的10 μl逆转录反应体系，进行逆转录，然后配制25 μl PCR反应体系，包括上述RT反应液、5×PCR缓冲液、灭菌水和引物(具体序列见表1)及EX Taq HS。反应条件：①94℃，2 min预变性;②94℃，30 s变性;③59℃，30 s退火;④72℃，1 min延伸;⑤72℃，5 min延伸;其中② ～ ④为30个循环。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，用WD-9413B凝胶成像分析仪进行拍照，并用Gel pro32凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析测定，Ⅰ型胶原的mRNA表达水平用Ⅰ型胶原/β-actin的光密度比值来表示。

表1 引物序列

1.5 统计方法

2 结果

2.1 给药60 d后左归丸对骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达水平的影响

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，通过图像分析软件检测，各个组分别于 193 bp(Ⅰ型胶原)、592 bp(β-actin)见到扩增的条带(见图1)，表明扩增条带与设计的引物相符合。经半定量RT-PCR检测显示：和正常组比较，假手术组骨组织中Ⅰ型胶原mRNA水平无明显差异(P＞0.05);与正常组比较，模型组大鼠大鼠骨组织中Ⅰ型胶原mRNA水平明显降低(P＜0.01);和模型组比较，左归丸高、中、低剂量组骨组织中Ⅰ型胶原mRNA水平显著上升(P＜0.01)，各用药组之间无显著性差异(P＞0.05)，和模型组比较，尼尔雌醇组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.01)。见表2。

图1 不同时间各组大鼠骨组织中Ⅰ型胶原mRNA表达的电泳照片

2.2 给药120 d后左归丸对骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达水平的影响

和正常组比较，假手术组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平无明显差异(P＞0.05);与正常组比较，模型组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平明显降低(P＜0.01);和模型组比较，左归丸高、中剂量组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.01)，左归丸低量组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.05);和左归丸低剂量组比较，左归丸高量组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著升高(P＜0.05);和模型组比较，尼尔雌醇组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.01)。见表2。

2.3 给药180 d后左归丸对骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达mRNA表达的影响

和正常组比较，假手术组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平无明显差异(P＞0.05);与正常组比较，模型组大鼠大鼠骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平明显降低(P＜0.01);和模型组比较，左归丸各剂量组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.01);和左归丸低剂量组比较，左归丸高、中量组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著升高(P＜0.01，P＜0.05);和模型组比较，尼尔雌醇组骨组织中Ⅰ型胶原的mRNA水平显著上升(P＜0.01)。见表2。

表2 不同时间各组大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA表达水平的变化± s，n=6)

表2 不同时间各组大鼠骨组织Ⅰ型胶原mRNA表达水平的变化± s，n=6)

与正常组比较：1)P＜0.01;与模型组比较：2)P＜0.05，3)P＜0.01;与左归丸低剂量组比较：4)P＜0.05，5)P＜0.01

组别60 d 120 d 180 d正常组0.73±0.07 0.91±0.06 0.93±0.02假手术组 0.71±0.05 0.90±0.01 0.92±0.04模型组 0.42±0.051) 0.72±0.021) 0.72±0.061)尼尔雌醇组 0.59±0.043) 0.86±0.023) 0.89±0.043)左归丸高剂量组 0.58±0.043) 0.84±0.023)4)0.93±0.043)5)左归丸中剂量组 0.55±0.043) 0.81±0.023) 0.90±0.013)4)左归丸低剂量组 0.51±0.023) 0.78±0.032) 0.84±0.023)

3 讨论

女性一般在50岁出现绝经，在绝经后10年内骨量丢失明显加快，绝经5年以内骨量丢失最快〔1〕。PMOP属于原发性OP的一种，为高转换型OP，以松质骨变化为主，故常见脊椎和腕部骨折〔2〕。雌激素替代疗法(ERT)被认为是治疗PMOP的有效方法，但ERT长期应用的依从性较差，使其应用受到一定的限制〔3〕。OP属于中医的“骨痹”或“骨痿”范畴。中医理论认为“肾为先天之本”，主生长发育与生殖;“肾藏精主骨生髓”，骨骼的生长、发育、修复均依赖于肾中精气的肾藏精，充盈、滋养与推动。《素问·痿论》曰：“肾者水脏也。今水不胜火，则骨枯而髓虚故足不任身，发为骨痿。”因此OP的发生主要是由于肾精亏虚所致，故内经中有“骨痿者，补肾法治之”的明确论述。绝经后妇女由于肾气虚衰，冲任不足，精枯髓少，充养乏源，骨失所养，则骨体枯槁，无以作强，则发为腰膝酸软、行走不便的骨痿或骨痛、骨痹。因此，补肾填精是防治PMOP的根本方法。左归丸为张景岳所创之经典方剂，具有滋阴补肾的功效。本实验研究采用的补肾名方左归丸出自《景岳全书》，方中熟地黄滋肾以填真阴;枸杞子益精明目;山茱萸涩精敛汗;龟、鹿二胶，为血肉有情之品，鹿角胶偏于补阳，龟板胶偏于滋阴，两胶合力，沟通任督二脉，益精填髓，有补阴中包涵“阳中求阴”之义;菟丝子配牛膝，强腰膝，健筋骨;山药滋益脾肾，诸药合用共收滋肾填阴，育阴潜阳之效。有文献报道左归丸能够卵巢切除大鼠外周血清中降钙素(CT)含量明显增高，骨钙素(BGP)含量明显降低〔4〕。本课题组的前期研究结果表明左归丸含药血清能够促进MC3T3-E1成骨前体细胞增殖，能够上调MC3T3-E1成骨前体细胞Runx2 mRNA的表达〔5〕。双侧去除卵巢后模型空白组大鼠肾组织内TGF-β1/Smad4信号转导通路出现异常，表现为TGF-β1、Smad4的mRNA水平过高表达，且骨密度降低，给予左归丸治疗60 d后，肾组织中TGF-β1、Smad4的表达均有下调趋势且骨密度显著升高，提示左归丸能通过下调肾组织中TGF-β1、Smad4的mRNA表达抑制骨吸收，纠正骨代谢紊乱，改善去绝经后机体肾虚的状态，通过补肾填精的途径起到防治PMOP的作用〔6〕。但是左归丸对OP时骨组织中Ⅰ型胶原表达的影响研究尚属空白。

Ⅰ型胶原是骨有机质的主要成分，占90%，由两条α1链和一条α2链交联而成。Ⅰ型胶原构成了骨组织蛋白框架，Ⅰ型胶原的合成与分解也是骨组织合成与吸收的直接和特异性指标。Ⅰ型胶原缺陷对骨密度影响不大，但可引起骨强度明显降低。Ⅰ型胶原的走向也可影响骨强度，较多的纵向胶原纤维可增加抗张力强度，混合性胶原可加强抗压力强度。OP使骨强度下降，因此Ⅰ型胶原在骨质疏松病因学中的作用机制受到广泛关注〔7〕。Ⅰ型胶原可以很好地反映骨代谢水平，还与骨密度改变、椎体及髋部骨折率良好相关，其敏感性、特异性、稳定性均高于以往的骨检测指标;对早期诊断和治疗OP，判断药物疗效和机制，预测骨折危险性具有重要价值。因此本实验观察了治疗不同时间、不同剂量左归丸对去卵巢大鼠股骨中Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，进一步探索左归丸对骨强度的影响。本实验结果说明Ⅰ型胶原的mRNA表达水平降低与OP发病密切相关;左归丸能够上调股骨组织中的Ⅰ型胶原mRNA表达水平，从而纠正OP时的骨代谢异常，这可能是左归丸作为补肾填精方剂防治PMOP的作用途径之一。

1 李 毅，于秋滨，陶天遵，等.中老年妇女骨质疏松症的流行病学调查〔J〕.中国骨质疏松杂志，2007;13(4)：263-6.

2 李 旭，白文佩，刘忠厚.绝经后妇女骨质疏松症的治疗进展〔J〕.中国骨质疏松杂志，2007;13(9)：607-12.

3 段水竹.中医药防治绝经后骨质疏松症的实验研究进展〔J〕.中国骨质疏松杂志，2006;12(6)：643-4.

4 鞠大宏，吴 萍，贾红伟，等.左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨钙素和降钙素含量的影响〔J〕.中国中医药信息杂志，2003;10(1)：16-7.

5 刘立萍，任艳玲，李 然，等.JUK通路对左归丸含药血清调控MC3T3成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012;18(14)：123-6.

6 任艳玲，李娅玲，吕海波，等.左归丸对去卵巢骨质疏松大鼠肾脏TGF-β1/Smad4 mRNA表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012;18(10)：171-5.

7 黄 强，沈 彬.Ⅰ型胶原与原发性骨质疏松的相关性研究进展〔J〕.华西医学，2009;24(1)：244-7.

Expressions of collagenⅠmRNA of femoral organization by Zuogui Pill in ovariectomy-induced osteoporosis rats

WANG Yan-Jie，REN Yan-Ling，SONG Nan，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China

Objective To observe the expression of collagenⅠmRNA of femoral organization by Zuogui Pill in ovariectomy-induced osteoporosis rats.Methods 280 male SPF SD rats were divided into normal and sham groups(n=39)and the other 195 rats were divided into ovariectomy-induced osteoporosis model group.21 days later，osteoporosis model rats were randomly divided into 5 groups：the model，nilestriol，high，middle and low dose of Zuogui pill groups(n=39).Then rats were given i.g.with Zuogui Pill at dosage of 6.4，3.2，1.6 g·kg-1·d-1and nilestriol respectively.Rats in normal，sham and the model groups were given distilled water.After treated with medicine 60，120，180 days，the expression of collagenⅠin the femoral organization was examined by RT-PCR.Results Compared with the normal group，the femoral collagenⅠ mRNA level obviously was reduced in model group(P＜0.01).Compared with the model group，collagenⅠmRNA level was significantly increased in Zuogui Pill groups(P＜0.01 orP＜0.05).Conclusions Expression of collagenⅠmRNA of bone tissue is down-regulated in postmenopausal osteoporosis，Zuigui pill can be up-regulated mRNA expression of collagenⅠin bone tissue.

Zuogui Pill;Osteoporosis;Collagen Ⅰ

R289.5 〔

A

1005-9202(2012)23-5170-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.032

国家自然科学基金项目(No.30873226);教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No.20102133110001);辽宁省高等学校优秀人才支持计划(No.LR201025);辽宁省科技厅自然基金(No.201102148)

任艳玲(1963-)，女，教授，博士生导师，主要从事方药配伍规律及作用机制的研究。

王艳杰(1976-)，女，副教授，硕士生导师，博士，主要从事中医药对脏腑调控作用的信号转导机制研究。

〔2012-07-26收稿 2012-10-10修回〕

(编辑 曹梦园)