氟病区成人雌激素受体α基因PvuⅡ多态性与骨组织异常的关系*

段雷振，杨跃进，周　桐，崔留欣，丁　中，李世宏，程学敏，赵明旭，周郭育，巴　月#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001　2)开封市疾病预防控制中心地方病科 开封 475000



氟病区成人雌激素受体α基因PvuⅡ多态性与骨组织异常的关系*

段雷振1)，杨跃进2)，周桐1)，崔留欣1)，丁中2)，李世宏2)，程学敏1)，赵明旭1)，周郭育1)，巴月1)#

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 4500012)开封市疾病预防控制中心地方病科 开封 475000

关键词氟；雌激素受体；基因多态性；骨组织

摘要目的：探讨雌激素受体(ER)α基因PvuⅡ多态性与氟暴露地区成人骨组织异常的关系。方法：采用整群抽样方法，在氟病区及对照区选择当地出生或居住5 a以上18～55岁的人群为观察对象；采用PCR-RFLP法分析ERα基因PvuⅡ多态性；采用X线检查两区人群骨组织改变。结果：暴露组和对照组人群骨组织异常率分别为65.34%和40.32%，差异有统计学意义(P<0.05)；以pp基因型为参照，暴露组携带Pp/PP人群骨组织异常的危险性增高(PR=1.087, 95%CI=1.053～1.437或PR=1.145, 95%CI=1.104～1.318)。结论：携带ERα PvuⅡPp/PP基因型可能增加骨组织对氟暴露敏感性。

ERα gene PvuⅡpolymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride

DUANLeizhen1),YANGYuejin2),ZHOUTong1),CUILiuxin1),DINGZhong2),LIShihong2),CHENGXuemin1),ZHAOMingxu1),ZHOUGuoyu1),BAYue1)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofEndemicDisease,KaifengCenterforDiseasePreventionandControl,Kaifeng475000

Key wordsfluoride;estrogen receptor;gene polymorphism;bone tissue

AbstractAim: To explore the relationship between estrogen receptor α(ERα) gene polymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride in drinking water.Methods: Adults aged from 18 to 55 years old who were born and grew or lived there for at least 5 years in endemic fluorosis villages or control villages were recruited using cluster sampling. They were allocated into endemic fluorosis group and control group in accordance with the above areas. PCR-RFLP was used to determine PvuⅡ genotype in ERα gene. X-ray was used to detect changes of the subjects′ bone tissue of the two groups.Results: The abnormal rate of bone tissue in endemic fluorosis group(65.34%) were significantly higher than that in control group(40.32%)(P<0.05). The increased risk of bone tissue abnormalities was observed in subjects carrying Pp/PP genotype of ERα gene compared with subjects carrying pp genotype from endemic fluorosis group(PR=1.087,95%CI=1.053-1.437;PR=1.145,95%CI=1.104-1.318).Conclusion: Bone tissue in people who carried ERα PvuⅡ Pp/PP genotype may be more susceptible to fluoride exposure.

氟斑牙和氟骨症是地方性氟中毒的特征性临床表现。骨密度受遗传因素和环境因素的共同影响[1-2]。研究[3]发现，雌激素受体(estrogen receptor,ER)基因突变可导致骨密度明显下降，过量氟摄入亦可造成骨质疏松、骨质硬化等骨相损伤。但目前为止，有关氟暴露与ERα基因多态性交互作用对骨组织改变的影响尚未阐明。该研究通过现况调查，应用X线检查暴露组人群骨组织变化，并运用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测ERα基因PvuⅡ多态性，以探讨氟暴露人群ERα基因PvuⅡ多态性与骨组织异常之间的关系。

1对象与方法

1.1调查点及调查对象的选择

1.1.1调查点的选择在准确监测水氟含量的基础上，选择河南省某县的5个村庄作为调查点，根据水氟浓度将5个村分为高氟区(水氟浓度2.44±1.88 mg/L)和对照区(水氟浓度0.37±0.15 mg/L)。除水氟浓度外，调查地区经济水平、自然条件、农作物种类、生活习惯、人口构成等均一致，且均无工业氟污染，调查区内其他环境介质氟水平差异无统计学意义[4]。

1.1.2调查对象的选择选取调查地区出生成长或居住5 a以上的18～55岁成人为调查对象。排除有骨代谢疾病和3个月内服用任何影响骨代谢药物者，包括甲状腺和甲状旁腺功能改变、Cushing综合征、慢性肝肾疾病和骨关节病者等，以及服用雌激素、降钙素、钙制剂及甲状腺激素者等。在满足上述条件人群中选择238例，其中对照区62人为对照组，高氟区176人为暴露组，对其进行健康体检、骨骼X线检查并抽取空腹外周静脉血。

1.2生物样本的采集研究对象于调查前日晚10点禁食，次日晨起抽取空腹外周静脉血10 mL(抗凝及非抗凝各5 mL)于-80 ℃低温保存，用于基因组DNA提取和ERα PvuⅡ多态性分析。

1.3骨组织异常情况检查及结果判定依照中国地方病防治办公室颁布的地方性氟中毒X线诊断标准，分别对前臂(包括肘关节及腕关节)、小腿(包括膝关节)及骨盆拍正位片，重点观察骨质、骨周和关节结构的改变。X线检查结果由影像专业医师判定，骨组织异常主要包括骨质疏松、骨质硬化、骨周软组织硬化、骨结构改变等。

1.4ERα PvuⅡ基因分型

1.4.1全血基因组DNA提取采用全血基因组抽提试剂盒(Axygen Biosciences,美国)提取基因组DNA。

1.4.2ERα PvuⅡ多态性分析参照相关文献[5]设计PCR扩增引物，并由上海博尚生物公司合成。上游引物：5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTC CTATTCTCC-3’，下游引物：5’-TCTTTCTCTGCCAC CCTGGCGTCGATTATCTGA-3’，产物大小1 300 bp。PCR体系为25 μL，其中基因组DNA 100 ng、2×Taq Master Mix 12.5 μL(康为世纪，北京)、ddH2O 6.5 μL、上和下游引物浓度为250 nmol/L。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s延伸，共 35个循环；72 ℃末端延伸5 min。PCR-RFLP反应体系为30 μL，其中PCR产物10.0 μL、PvuⅡ内切酶1.0 μL(MBI Fermentas，立陶宛)、10×Buffer Tango 2 μL、ddH2O 17 μL，37 ℃酶切4 h。PCR产物经PvuⅡ酶切后，置15 g/L琼脂糖电泳，紫外灯下，存在PvuⅡ酶切位点的纯合子(pp)显示800 bp和500 bp两条带；缺乏PvuⅡ酶切位点的纯合子(PP)显示1 300 bp一条带；杂合子(Pp)显示上述三条带。

1.5统计学处理采用EpiData 2.0建立数据库，以双人双机独立录入方式对问卷数据及测定结果录入。数据分析采用SPSS 12.0。基因多态性分析以Hardy-Weinberg平衡吻合度检验确定对照组遗传平衡状况。ERα PvuⅡ各基因型在不同性别人群中的分布分析采用χ2检验。两组人群骨组织异常率、ERα PvuⅡ不同基因型人群骨组织异常率比较采用log-binomial。采用logistic回归分析氟暴露与ERα基因PvuⅡ多态性交互作用对骨组织改变的影响。检验水准α=0.05。

2结果

2.1两组人群基本情况比较结果见表1。2组人群年龄分布、吸烟及饮酒状况差异均无统计学意义。无论男性和女性，暴露组人群尿氟水平均高于对照组，差异有统计学意义，对照组人群ERα PvuⅡ基因型分布符合遗传平衡(χ2=1.196,P=0.274)。

表1　两组人群基本情况比较

2.2两组人群骨组织异常情况比较结果见表2，暴露组骨组织异常率明显高于对照组，其差异有统计学意义，校正年龄及性别因素后，暴露组人群骨组织异常的危险性增加。

表2　两组人群骨组织异常情况比较

*：以年龄、性别为校正因素。

2.3ERα PvuⅡ基因多态性与骨组织异常关系

2.3.1两组人群ERα PvuⅡ3种基因型的分布结果见表3。ERα PvuⅡ基因型在两组不同性别人群中分布的差异无统计学意义。

表3　两组不同性别

2.3.2携带ERα PvuⅡ不同基因型人群骨组织异常率比较见表4。由表4可知，校正年龄、性别及尿氟浓度后，暴露组携带Pp及PP基因型个体骨组织异常率明显高于携带pp基因型个体。

2.3.3氟暴露与ERα基因PvuⅡ多态性交互作用对骨组织的影响见表5。校正年龄、性别及尿氟水平后，氟暴露与ERα基因PvuⅡ多态性不存在交互作用。

表4　携带ERα PvuⅡ不同基因型人群骨组织异常率比较

*:以年龄、性别及尿氟浓度为校正因素。

表5　 氟暴露与ERα基因

*：以年龄、性别及尿氟为校正因素。

3讨论

3.1氟暴露对人群骨组织的影响该研究结果显示，暴露组人群骨组织异常率明显高于对照组人群，在校正了年龄及性别因素后，暴露组人群骨组织异常的危险性较对照组增加，提示即使在水氟浓度较低的轻病区，长期暴露亦可导致骨质疏松、骨质硬化、骨周软组织硬化、骨结构改变等骨组织异常率增加，与以往研究结果一致[6]。

3.2ERα PvuⅡ基因多态性与骨组织异常关系该研究选择汉族成年人群[7]为研究对象，结果显示ERα PvuⅡ基因型在不同地区、不同性别人群中的分布一致。在调整年龄、性别及尿氟浓度后，以pp基因型为参照，在氟暴露情况下携带Pp和PP基因型骨组织异常的危险性分别增加了9%和15%，提示携带Pp/PP基因型个体比携带pp基因型个体对氟暴露更为敏感，可能更容易发生骨质疏松、骨质硬化等骨组织异常改变。以往有关ERα基因PvuⅡ多态性对女性骨密度的影响研究结果不尽一致；Jeedigunta等[8]研究表明，携带pp基因型个体的骨密度明显较PP基因型低；而Kobayashi等[9]研究表明，携带pp基因型女性骨密度较携带Pp或PP基因型女性骨密度高。鉴于机体对环境暴露的易感性不同，该研究就氟暴露与ERα基因PvuⅡ多态性交互作用对骨组织异常的影响进行了分析。未观察到氟暴露与ERα基因PvuⅡ多态性存在交互作用。由于机体骨代谢受多种因素影响。因此，从基因水平探索氟暴露与骨组织异常的关系，应进一步扩大样本量，从多基因、多因素的角度深入研究。

致谢：感谢参与课题现场调查工作的郑州大学公共卫生学院、开封市疾病预防控制中心及通许县疾病预防控制中心地方病科的工作人员；感谢所有参与此项研究的调查对象。

参考文献

[1]颜晓东,胡映玉,陈友华,等.广西南宁地区健康人群骨密度十年前后比较[J].中国骨质疏松杂志,2014(11):1352

[2]常凤,魏亚茹,赵文艳.哈尔滨地区379例女性跟骨超声骨量的研究[J].中国骨质疏松杂志,2009,15(10):763

[3]王金堂,贾光辉,刘广宇,等.雌激素受体基因多态性与陕西关中地区绝经后妇女骨密度的相关性[J].西安交通大学学报(医学版),2008,29(2):206

[4]崔蕊蕊,丁中,崔留欣,等.饮水氟暴露对成年男性血清睾酮及雄激素结合蛋白的影响[J].郑州大学学报(医学版),2013，48(6):750

[5]JAKIMIUK A,NOWICKA M,BOGUSIEWICZ M,et al.Prevalence of estrogen receptor alpha PvuⅡ and XbaⅠ polymorphism in population of polish postmenopausal women[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(4):331

[6]巴月,余波,马建国,等.Ⅰ型胶原α2链基因多态性及其与氟暴露人群骨组织异常关系的分析[J].中国地方病学杂志,2006,25(4):386

[7]刘浩,刘志红,陈朝红,等.雌激素受体基因多态性在中国汉族人群中的分布特点[J].肾脏病与透析肾移植杂志,1999,8(2):105

[9]KOBAYASHI N,FUJINO T,SHIROGANE T,et al.Estrogen receptor alpha polymorphism as a genetic marker for bone loss, vertebral fractures and susceptibility to estrogen[J].Maturitas,2002,41(3):193

中图分类号R599

#通信作者，女，1963年7月生，博士，教授，研究方向：环境相关疾病分子发病机制，E-mail:byyue@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.010

*国家自然科学基金资助项目81072247；河南省教育厅科学技术研究重点项目13A330653