重组家蚕素Ⅱ基因稳定转染HepG2细胞及鉴定

王玲玲 吴 雷 杜珍武 张玉成 张桂珍 (吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 30033)

重组家蚕素Ⅱ基因稳定转染HepG2细胞及鉴定

王玲玲1吴 雷2杜珍武 张玉成 张桂珍 (吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033)

目的 重组家蚕素Ⅱ基因(MBbxⅡ)稳定转染HepG2细胞，为研究MBbxⅡ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础。方法 含有MBbxⅡ质粒转化大肠杆菌DH-5α感受态菌，挑取单克隆摇菌，中量提取质粒，转染HepG2细胞45 d，G418筛查。挑细胞单克隆继续培养，待细胞融合80%提取RNA并进行逆转录，RT-PCR鉴定目的条带。结果 稳定转染MBbxⅡ于HepG2细胞中，转染后细胞可正常分裂增殖。结论 本研究成功稳定转染MBbxⅡ基因于HepG2细胞中。

家蚕素;稳定转染;HepG2

通过多年研究，家蚕全基因组精细图谱现已完成。通过家蚕核酸数据库、蛋白质数据库及EST数据库等各种二次数据库的构建和完善，为家蚕功能基因及其产物的研究提供了一个便利的技术平台〔1〕。与此同时研究也遇到一个问题——家蚕素(Bbx)蛋白提取及纯化困难。本研究小组为寻找可以大量提取Bbx蛋白的方法，对野生型家蚕素基因进行改造，将改造后家蚕素基因稳定转染于HepG2细胞中，为后续研究其在哺乳动物体内的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含有重组家蚕素基因的PcDNA3.0及PcDNA3.0空质粒由吉林大学第三临床医院中心研究室馈赠。质粒中量提取试剂盒、G418、高糖DMEM、Hyclone优质胎牛血清、胰酶、Lipotap脂质体转染试剂盒、UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、BioTeke super RT Kit及引物合成均购自上海生工。DNA Marker2000、2 ×Hostestart Taq PCR Master Mix均购自北京天根公司。

1.2 方法

(1)质粒pcDNA3.0-MBbxⅡ/His及空质粒pcDNA3.0转化入DH-5α感受态细胞。(2)在平皿中所见的白色菌落为成功转化的克隆。挑取单克隆摇菌。(3)根据质粒中量提取试剂盒说明书中量提取pcDNA3.0-MBbxⅡ/His及pcDNA3.0质粒。对所提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，检测质粒提取成功。(4)选择出在10～14 d内使HepG2细胞全部死亡的最低G418浓度进行下一步的筛选实验。(5)使用Naro-Drop ND-2000微量紫外分光光度计测定两种质粒含量。(6)应用Lipotap脂质体将质粒 pcDNA3.0-MBbxⅡ/His及空质粒pcDNA3.0稳定转染入HepG2细胞。(7)对稳定转染后HepG2细胞进行传代，当细胞稳定生长并传代(第10代左右)后提取RNA并逆转录为cDNA。(8)半定量RT-PCR检测MBbxⅡ基因在mRNA水平的表达：①PCR引物设计：根据GenBank中BbxⅡ基因的cDNA序列，利用Primer Primier 5.0软件设计特异性引物(见表1)。②半定量RT-PCR反应(以逆转录cDNA为模板)。PCR 反应体系：Template 1 μl、上游引物 1 μl、下游引物1 μl、2 × Master Mix12.5 μl、ddH2O 补至 25 μl;PCR 反应条件：94℃预变性 10 min，94℃ 变性 30 s、55℃ 退火 30 s、72℃延伸1 min共30个循环，72℃ 延伸10 min。(9)取PCR扩增产物5 μl，加10 × 电泳上样缓冲液2 μl，混匀，加样于2%的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为0.5×TBE，5 V/cm电压条件下电泳，于紫外灯下观察结果并照相。

表1RT-PCR引物

2 结果

2.1质粒转化及中量提取

平皿过夜培养后取出，肉眼下可见大量单个白色菌落。质粒中量提取后取5 μl提取的质粒进行电泳。以Marker2000作对照，紫外灯下拍照结果见图1。可见清晰的目的条带，表明成功提取质粒。

2.2 Lipotap脂质体稳定转染

经G418的浓度筛选确定稳定转染使用浓度为800 mg/L，后续实验中的维持浓度为400 mg/L。所提取质粒经Naro-Drop ND-2000微量紫外分光光度计测定 DNA 含量：pcDNA3.0-MBbxⅡ/His质粒246 ng/μl，OD260/OD280=1.829，pcDNA3.0 质 粒：37 ng/μl，OD260/OD280=1.721。在G418筛选45 d时，倒置显微镜下观察细胞，各组细胞已形成单克隆，且未转染组HepG2细胞已全部死亡(见图2)。表明质粒稳定转染成功。

2.3 细胞提取RNA及半定量RT-PCR检测MBbxⅡ基因在mRNA水平的

稳定转染细胞融合达90%进行细胞RNA提取并进行逆转录。实验分为转染pcDNA3.0-MBbxⅡ/His HepG2细胞组、转染空质粒pcDNA3.0 HepG2细胞组、未转染HepG2细胞组。半定量RT-PCR产物经凝胶电泳结果显示：三组细胞均可见到内参，且仅在转染pcDNA3.0-MBbxⅡ/His组细胞可见目的条带即MBbxⅡ(308 bp)条带(见图3)，表明MBbxⅡ基因已成功稳定转染HepG2细胞。

图1 提取质粒的电泳图

图2 Lipotap脂质体稳定转染HepG2细胞(×100)

图3 稳定转染细胞RT-PCR电泳图

3 讨论

人类在深入研究哺乳动物存在胰岛素或胰岛素相关肽后，对无脊椎动物也进行了大量研〔2〕。现已证明胰岛素相关肽也广泛存在于昆虫体内，例如果蝇〔3〕、甘比亚疟蚊(Anopheles gambiae)〔4〕、灰翅夜蛾 (Spodoptera mauritia Boisduval)〔5〕等。1982年，在分离家蚕促前胸腺激素(prothoraci-cotropic hormone，PTTH)的过程中，从65万头家蚕的头部仅分离纯化出约50 μg大小为5 kD的多肽〔6〕;并且在后续的实验中发现，在生理剂量范围内，该多肽却不能活化家蚕的前胸腺〔7〕。研究中发现该多肽的氨基酸序列与高等动物的胰岛素高度同源，但功能却不尽相同〔8〕，倍受关注的研究热点是Bbx也具有与胰岛素相似的对糖代谢的调节作用。有研究显示家蚕的淋巴液中含有大量的海藻糖，Bbx表现出剂量依赖性的降低淋巴液中海藻糖含量的作用，同时Bbx在脂肪体中表现出降低糖原含量的作用〔9〕。

为实现家蚕素基因的高效表达，本研究小组在先期实验中制备了含有家蚕素N-端信号肽序列的真核表达载体，这有助于基因表达产物通过细胞膜实现转运过程，同时该载体还含有Kozak序列(GCCACCATGG)，这在很大程度上可以提高家蚕素在哺乳动物细胞中的表达水平，借此可望实现在哺乳动物细胞获得分泌性的家蚕素。本研究通过基因重组技术对家蚕素Ⅱ基因进行改造，构建质粒 pcDNA3.0-MBbxⅡ/His，稳定转染HepG2细胞。G418筛选45 d时，倒置显微镜下观察细胞，稳定转染质粒pcDNA3.0-MBbxⅡ/His的HepG2细胞已经成功形成单克隆，后续提取细胞RNA并进行RT-PCR实验，证实308 bp处得到目的条带，为后续探讨MBbxⅡ在哺乳动物体内的生物学作用奠定基础。

1 孔祥宾，徐世清.家蚕类胰岛素肽的结构及信号传导与作用〔J〕.蚕业科学，2010;36(3)：458-64.

2 Iwami M.Bombyxin：An insect brain peptide that belongs to the insulin family〔J〕.Zool Sci，2000;17(8)：1035-44.

3 Brogiolo W，Stocker H，Ikeya T.An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin2 like peptides in growth control〔J〕.Curr Biol，2001;11(4)：213-21.

4 Riehle F，Garczynski SF，Crimj W，et al.Neuropeptides and peptide hormones in Anopheles gambiae〔J〕.Science，2002;298(5591)：172-5.

5 van De Velde S，Badisco L，Claeys I，et al.Insulin-like peptides in Spodoptera littoralis(Lepidoptera)：Detection，localization and identification〔J〕.Gen Comp Endocr，2007;153(1-3)：72-9.

6 Suzuki A，Nagasawa H，Kataoka H，et al.Isolation and characterization of prothoracicotropic hormone from silkworm Bombyx mori〔J〕.Agric Biol Chem，1982;46(4)：1107-9.

7 Ishizaki H.Molecular characterization of the brain secretory peptides，prothoracicotropic hormone(PTTH)and bombyxin，of the silkmoth bombyx mor〔iJ〕.Proc Jpn Acad Ser B，2004;80(5)：195-203.

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9 李洪霞，杜珍武，张玉成，等.家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞中的表达〔J〕. 中国老年学杂志，2011;2(31)：634-6.

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A 〔

1005-9202(2012)04-0782-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.04.052

1 北华大学附属医院神经内科 2 吉林市中心医院心胸外科

张桂珍(1955-)，女，教授，博士生导师，主要从事糖尿病分子发病机制研究。

王玲玲(1983-)，女，主治医师，在读博士，主要从事糖尿病诊断与治疗研究。

〔2011-07-30收稿 2011-09-10修回〕

(编辑 徐 杰)