犬α-干扰素蛋白原核表达及条件优化

李桂伟 周庆民 樊兴冬 冯万宇 秦 博 高俊峰

（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006）

随着生活水平的日益提高，犬在人类的生活中占据越来越重要的地位，如作为宠物、警犬、搜救犬等。但是，犬类的各种病毒性疾病严重危害着犬类的健康和生存，也影响着我国养犬业的发展。为防止不同原因造成的免疫程序失败，犬类病毒病的预防和治疗显得尤为重要。因此，临床上迫切需要安全、有效、副作用少的干扰素制剂。

干扰素（IFN）是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，具有阻止病毒繁殖、调节机体免疫反应的生物学功能，是当今应用前景最为广阔的重要生物制剂之一[1，2]。IFN按其细胞来源可分为α、β及γ3种类型。其中，IFN-α是由能在脊椎动物各种类型的细胞中增殖的病毒诱导白细胞产生的，主要活性是抗病毒[3-5]。因此，本试验采用犬的肝脏组织扩增干扰素基因，并进一步筛选出高效表达干扰素蛋白的原核表达系统，为犬α-干扰素的体外大量表达提供了依据。

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物组织、菌种及质粒

犬肝脏由齐齐哈尔市警犬基地提供；pBV220载体由本实验室保存；大肠杆菌E. coli DH5α、BL21、Rosetta由本研究室制备保存。

1.1.2 主要试剂

PremixTaq DNA聚合酶；DNA makerDL2000；T4 DNA连接酶；限制性内切酶EcoRI、SalI等购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自原平皓（天津）生物技术有限公司。

1.2 引物设计与合成

参照GenBank中发表的犬α-干扰素基因（EF990625）去掉信号肽后设计1对引物，引入EcoRI、SalI酶切位点。引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：上游引物序列：5-'ATAGAATTCAGACCTGCCCGACGCC-3’，下游引物序列：5-'TACGTCGAC TCATTTCCT CCTCCTGATTCT -3 ‘

1.3 试验方法

1.3.1 犬肝脏组织基因组的提取

将肝脏研磨成匀浆，用灭菌生理盐水稀释。参照V-gene DNA提取试剂盒说明书方法提取肝组织DNA，-20℃保存备用。

1.3.2 犬肝脏细胞基因的扩增

以提取的肝组织DNA为模板进行PCR扩增，在50μL PCR扩增体系中加入PremixTaq酶2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板10μL、补去离子水36μL，混匀瞬时离心后进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min后进入PCR循环，94℃变性1min，56℃退火1min20s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。0.8%琼脂糖胶凝电泳观察PCR扩增结果。

1.3.3 犬α-干扰素基因的克隆及转化

参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，回收特异的DNA条带。将回收纯化的PCR产物与pBV220载体分别经酶切后进行连接，转化DH-5α、BL21、Rosetta感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养12～16 h。挑取单个菌落接种含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养12～16 h。用质粒快速提取试剂盒提取重组质粒，对重组质粒用PCR和EcoRⅠ、SalI进行酶切及测序鉴定，确定为犬α-干扰素基因序列。

1.3.4 犬α-干扰素蛋白表达及条件优化

1.3.4.1 干扰素-α蛋白的原核表达

挑取单个菌落接种于含50μg/mLAmp+的LB液体培养基中，30℃培养过夜。同时，设置未连接目的基因的空载体转化的DH-5α、BL21、Rosetta作为对照组。取上述过夜培养物以1%的比例接种于新鲜含50μg/mL Amp+的LB液体培养基中，30℃振荡培养2～3 h，当OD600至0.4～0.6时，放到42℃恒温水浴中热激并继续培养，诱导表达。

1.3.4.2 干扰素-α蛋白的原核表达条件优化

表达时间优化：将DH-5α、BL21、Rosetta 3种含pBV220-CaIFN-α的阳性工程菌以1‰量分别接入液体LB培养基中，30℃振荡过夜，以1%量接入液体LB培养基中30℃继续培养3～4 h，当OD600约等于0.4-0.6 时，快速变温至42℃，诱导表达6 h。诱导后每小时分别留取样品。同时设诱导前和空载体对照组。根据诱导时间的不同确定各宿主菌的最佳表达时间。

宿主菌优化：取DH-5α、BL21、Rosetta 3种宿主菌最优表达时间做SDS-PAGE，并比较各宿主菌的表达量，确定最佳宿主菌。

通过诱导时间及表达宿主菌的不同，确定最佳表达条件。采用SDS-PAGE 电泳鉴定表达产物。

2 结果

2.1 犬α-干扰素基因PCR扩增产物的鉴定结果

犬α-干扰素基因PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，在约520 bp处可见特异性DNA条带，大小与预期相符（如图1所示）。

2.2 阳性重组质粒的鉴定结果

取阳性重组质粒pBV220-CaIFN-α分别用PCR鉴定，限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行单双酶切鉴定，双酶切获得2个片断，分别为约3 660 bp的载体片断和约520 bp的CaIFN-α基因。用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行单酶切，获得约4 200 bp片断，结果与预期带大小相符（如图2所示）。

2.3 干扰素-α基因的测序结果

干扰素-α基因的测序结果与预期结果相符。推导氨基酸序列，通过在线软件分析，试验获得的犬干扰素-α基因与天然犬干扰素-α的同源性为99.9%。

2.4 干扰素-α的表达及条件优化

2.4.1 诱导时间的优化结果

条件相同时，在相同宿主菌中，由于诱导时间的不同蛋白表达量也存在差异，因此本试验比较了在相同宿主菌中诱导时间的长短对蛋白表达量的影响（结果如图3-1、3-2、3-3所示）。Rosetta -pBV220-CaIFN-α诱导后1～6 h表达量分别为：1 h 11%、2 h 16%、3 h 17%、4 h 29%、5 h 18% 6 h 24%，蛋白在Rossta宿主菌中4 h表达量最高，表达量约为29%；BL21-pBV220-CaIFN-α诱导后1～6 h表达量分别为：1 h 11%、2 h 14%、3 h 16%、4 h 22%、5 h 27%、6 h 21%，蛋白在BL21宿主菌中5 h表达量最高，表达量约为27%；DH5α- pBV220-CaIFN-α诱导后1～6 h表达量分别为：1 h 9%、2 h 16%、3 h 19%、4 h 32%、5 h 23%、6 h 15%，蛋白在DH5α宿主菌中4 h表达量最高，表达量约为32%。

2.4.2 宿主菌的优化结果

对于不同的宿主菌，蛋白的表达量也存在差异，因此本试验具体比较了3种宿主菌对蛋白表达量的影响（如图4-1所示）。图中显示，蛋白在DH-5α宿主菌中表达量最高，为32%左右。在相同条件下，同一宿主菌中，诱导时间的不同蛋白表达量也存在差异。根据诱导时间，宿主菌的不同确定出最佳诱导时间为4 h，最佳宿主菌为DH-5α。

3 讨论

对于犬病毒病的预防，目前国内主要采用注射犬五联弱毒疫苗，但由于母源抗体的干扰及毒株的抗原漂移，常导致免疫失败，因此研制安全高效的干扰素抗病毒制剂具有重大意义。由于犬α-干扰素属于Ⅰ型干扰素，由不含内含子的多拷贝基因编码，因此本研究直接以犬肝基因组DNA为模板克隆出了犬α-干扰素基因，省去了从白细胞中提取mRNA为模板进行RT-PCR扩增的繁冗。由于大肠埃希菌表达系统具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点[6]，因此试验中选择DH-5α、BL21、Rosetta 3种宿主菌作为试验对象，确定了表达蛋白的最佳时间和高效表达的宿主菌，为表达产物的纯化提供前提。研究结果表明，本试验构建的工程菌在DH-5α宿主菌中4 h时表达量最高，为进一步探讨犬α-干扰素蛋白的生物学特性、研制新型犬α-干扰素制剂，对我国犬α-干扰素生物制剂的生产、犬类病毒病的防治奠定了基础。

[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2001.

[2]Sun K，MetzgerDW. Inhibition ofpulmonary antibacterialdefense by interferon-gamma during recovery from influenza in-fection[J].NatMed，2008，14（5）：558-564.

[3]孙亚萍，王英明，乔守怡，等.干扰素及其最新研究进展[J].中国免疫学杂志，2006，22（7）：676-679.

[4]童葵塘.重组干扰素α的抗病毒活性及其临床作用[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：85-88.

[5]李云富，张水华，何凌冰，等.重组人干扰素α脂质体乳膏的抗病毒作用及毒理学研究[J].中国生物制品学杂志，2008，21（6）：510-512.

[6]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual. 3rd eds.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002：934.