生物钟基因Npas2在老年乳腺癌患者中的表达及其临床意义

李新白 袁 彤 金美善 佟 倜 (吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 300)

流行病学研究显示，机体昼夜节律周期的破坏如长期熬夜、倒班工作、跨时区飞行等与乳腺癌的发生相关〔1，2〕。生物的昼夜节律失调是肿瘤发生和进展的内在因素之一〔3〕，生物钟基因对人体的病理生物周期行为的调控具有重要作用。Npas2基因是已检测到的最大生物钟基因，在中枢和外周组织中均有表达。证据表明，生物钟基因Npas2在细胞周期调控、DNA损伤修复和肿瘤生长抑制等过程中参与肿瘤的发生和发展〔4，5〕。但Npas2基因在乳腺癌中如何表达以及与乳腺癌病理分型、转移、侵袭的关系国内报道不多。本研究旨在探讨Npas2与乳腺癌生长和侵袭的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 选择吉林大学第一医院2009年4月至2009年12月行乳腺手术的患者50例。临床资料齐全，年龄60～72〔平均 (66.8±6.5)〕岁。所有病例术前均未行放射和化学治疗，且经术后病理证实，其中乳腺原位癌20例，乳腺浸润癌30例，行乳腺癌改良根治术;距离病变3 cm以上取瘤旁组织作为正常乳腺组织，共50例，术后均经病理证实。根据国际抗癌联盟 (UICC)分期标准进行分期，Tis 20例，Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期5例;有淋巴结转移11例，无淋巴结转移19例。

1.1.2 试剂 Npas2抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;生物素-亲和素-过氧化物复合物 (SP)-9710试剂盒和二氨基联苯胺 (DAB)试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 Npas2蛋白免疫组化 取临床标本组织制成4 μm切片2张，1张切片用于苏木素-伊红 (HE)染色，1张用于免疫组化。Npas2抗体检测采用免疫组化SP法，DAB显色。切好的石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。滴加3%过氧化氢溶液室温处理10 min，以消除内源性过氧化物酶。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗 (5 min×3次)。正常山羊免疫血清封闭，室温孵育15 min，倾去血清，滴加按1∶100稀释的Npas2抗体，4℃冰箱过夜。PBS冲洗 (5 min×3次)。滴加生物素标记的二抗，室温10 min。PBS冲洗 (5 min×3次)。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温10 min。PBS冲洗 (5 min×3次)。DAB显色。常规HE复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.3 结果判定 Npas2抗体染色阳性物表达于细胞质和细胞核为棕黄色颗粒;细胞核用HE复染，阳性的染为紫黑色，阴性为胞核蓝色，细胞质无色。每张切片采用Motic Images Advanced 3.2图像分析仪，在200倍镜下连续观察5个视野检测，测量灰度值，以灰度值表示Npas2蛋白表达情况，灰度值越小阳性表达越高。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，抗体灰度值采用s表示，组间比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 在乳腺正常组织、乳腺原位癌和浸癌癌中Npas2蛋白的表达 Npas2蛋白在正常乳腺组织、乳腺原位癌和浸润癌中均有表达，在正常乳腺组织中，可见细胞质内大量棕黄色颗粒染色，NPAS2阳性表达灰度值为114.3±2.31;在原位癌中，细胞质内抗体灰度值为132.3±2.11;在浸润癌中细胞质表达明显降低，呈淡黄色或着色浅，其灰度值为159.5±6.79。与正常组织比较，浸润癌和原位癌中Npas2蛋白表达差异有统计学意义 (P＜0.05)。见图1～图3。

2.2 Npas2蛋白的表达与乳腺肿瘤病理特征的关系 乳腺原位癌和乳腺浸润癌免疫组化染色发现，Npas2表达与肿瘤分期有相关性。与原位癌 (132.3±2.11)和Ⅰ期乳腺癌(142.3±2.46)比较，在Ⅱ期 (161.2±4.22)和Ⅲ期(176.3±2.93)乳腺癌中Npas2表达明显减弱，差异有统计学意义 (P＜0.05)。乳腺浸润癌中，有淋巴结转移 (166.3±4.04)与无淋巴结转移 (156.8±3.23)比较，Npas2蛋白表达差异无统计学意义 (P＞0.05)，考虑可能与纳入的样本数不够有关。

图1 Npas2在正常乳腺组织中的阳性表达(×200)

图2 乳腺原位癌中Npas2蛋白的表达(×200)

图3 乳腺浸润癌中Npas2蛋白的表达(×200)

3 讨论

生物体的许多活动和生理行为均以24 h为周期呈节律性振荡。生物节律在分子水平表现为生物钟基因及其相关蛋白产物可以作为肿瘤抑制因子，参与调控细胞分裂、增殖、凋亡和细胞周期〔5〕。目前普遍认为，肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受多种基因和蛋白等因素控制;同时，肿瘤的发生与发展是一个多因素作用、多基因参与、经过多阶段才最终形成的极其复杂的生物学现象。对人体肿瘤研究发现，生物的昼夜节律失调是肿瘤发生和进展的内在因素之一。昼夜节律的破坏与乳腺癌的发生相关〔1，2〕，是现在研究的热点之一。

许多学者认为Npas2可能作为潜在肿瘤抑制因子〔6，7〕，在细胞周期调控、DNA损伤修复和肿瘤生长抑制的过程等多方面参与肿瘤的发生和发展。现有证据表明，Npas2的基因多态性和基因错义突变与人类肿瘤包括乳腺癌和淋巴瘤的发病危险存在一定的联系〔6，8〕。Npas2基因编码一种具有碱性螺旋-环-螺旋/过碘酸-雪夫结构域 (basic helix-loop-helix-PAS，bHLHPAS)转录因子家族蛋白质，在前脑和外周组织均有表达。bHLH-PAS蛋白是控制多种生理发生和发育过程基因表达的重要调节因子，在控制各种细胞事件中起着关键作用〔4〕。Npas2蛋白与BMAL1蛋白形成异二聚体，与靶基因启动部位的e盒结合，启动Per1、Per2、Per3和Cry1、Cry2基因的表达，从而调节生物节律〔9，10〕。PER和CRY蛋白是反馈环中的负性因素。考虑Npas2可能作为潜在的肿瘤抑制因子，其蛋白在肿瘤中表达可能是下调的。

本研究结果发现Npas2蛋白在正常乳腺组织呈阳性表达，在乳腺原位癌和浸润癌中表达较正常乳腺组织明显减弱，推测Npas2蛋白存在于正常乳腺组织中维持乳腺正常形态和功能，NPAS2表达减弱可能使乳腺组织的形态和功能发生改变，可能导致乳腺癌的发生。提示Npas2表达在乳腺癌的发生、发展中起着重要的作用。同时发现，Npas2表达与肿瘤分期有相关性，在乳腺原位癌和I期浸润癌中表达相对较高，提示Npas2高表达可能在乳腺癌发展中具有保护性作用。体内和体外实验已证实生物钟基因Per1和Per2高表达能抑制乳腺肿瘤细胞的生长。Per1和Per2是Npas2作用的靶基因，Npas2高表达可能刺激Per1和Per2高表达，从而抑制乳腺癌细胞的生长。这可能从分子水平解释乳腺癌Npas2高表达和良好生存预后的关系。

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