新疆和田地区维吾尔族帕金森病LRRK2基因S1647T多态性分析

闫荟如 马青平 杨新玲 李红娟 (新疆医科大学第一附属医院神经医学中心，新疆 乌鲁木齐 830054)

帕金森病(PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，各研究表明遗传因素在PD的病因中起着重要作用，其中LRRK2是重要的易感基因之一。目前已证实LRRK2基因约有20多个突变位点与PD相关，突变类型具有明显的区域和种族差异性。目前尚未见国外学者对S1647T多态的研究报道，我国大陆的Zheng等〔1〕和台湾的 Lin等〔2〕研究发现该多态与中国汉族人群PD的发生有关。本研究选择新疆和田地区维族帕金森患者及健康对照者为研究对象，观察LRRK2基因多态位点S1647T与新疆和田地区维族帕金森病的关系。

1 对象与方法

1.1 诊断标准 病例组为在流调基础上得到的PD患者(均为散发性)，对照组为从调查地点选择的生活背景与PD患者相似，年龄、性别、族别等相互匹配，并且经严格检查确定无血缘关系的健康非PD者。以英国BrainBank诊断标准进行筛查，部分诊断困难者再由神经内科资深专家进行审核确诊，必要时行头颅核磁或CT证实。发病年龄以50岁为界分为早发PD组和迟发PD组。排除继发性PD和帕金森叠加综合征以及神经系统其他疾病、甲状腺功能亢进、遗传病等。

1.2 一般资料 病例组124例，男72例，女52例，发病年龄31～95(62.7±12.6)岁;对照组130名，男76例，女54例，年龄33～90(60.9±11.6)岁。病例组与对照组的性别构成、年龄间差异均无统计学意义(χ2性别 =0.004，P＞0.05;t年龄 =1.138，P ＞0.05)。

1.3 方法

1.3.1 DNA制备 所有患者及正常对照者都经知情同意。取外周肘静脉血2 ml按常规酚/氯仿法抽提基因组DNA，检测DNA 纯度在1.7～1.9，浓度≥10 ng/μl，－20℃保存。

1.3.2 引物的设计 根据National Center for Biotechnology Information(NCBI)及ensembl中的DNA序列库中LRRK2基因S1647T所在的Exon34的DNA序列，设计S1647T引物序列，上游：5'-CTTCTAGGCCACATGGTTG-3';下 游：5'-TCCTATTGGCAAAGCAATCT-3'，扩增片断长度为326 bp，引物由北京华大生物公司合成。

1.3.3 扩增LRRK2基因第34号外显子 PCR总体积为25 μl。100 ng/μl上下游引物各为 0.5 μl，MIX10 μl，50 ng/μl gDNA 3.0 μl，ddH2O 11 μl。PCR 反应条件为：S1647T 反应条件：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，57.8℃退火 30 s，72℃延伸20 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.4 PCR扩增产物检测与基因型鉴定 取7 μl PCR产物，加入上样缓冲液(2×溴芬兰)混匀后，上样于2%琼脂糖凝胶，核酸染料染色，D50 Marker做标准对照，4 V/cm电压电泳，紫外仪上观察，拍照。扩增片段长度为326 bp。

1.3.5 DNA测序法基因型分析 TT型为纯合子(野生型);TA型为杂合子突变;AA型为纯合子突变。

1.4 统计学方法 使用 SPSS17.0软件进行分析。基因型频率及等位基因频率采用基因计数法，计数资料以率(%)表示，两组间等位基因频率和基因型频率分布的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验 病例组与对照组两个多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，吻合度良好(PD 组 χ2=0.080，P ＞0.05，对照组 χ2=0.410，P ＞0.05)。

2.2 LRRK2基因S1647T位点多态性测序结果 见图1。

图1 LRRK2基因S1647T多态位点测序图

2.3 PD组与对照组S1647T多态基因型频率和等位基因频率比较 PD组和对照组基因型频率和等位基因频率比较，差异无统计学意义(χ2=0.98，P=0.613 和 χ2=0.218，P=0.64)。见表1。

表1 PD组与对照组S1647T多态基因型频率和等位基因频率比较〔n(%)〕

2.4 不同年龄PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较 早发PD组与≤50岁对照组(χ2=0.953，P=0.621和χ2=0.584，P=0.445)，迟发 PD组与 ＞50岁对照组(χ2=0.384，P=0.825 和 χ2=0.019，P=0.891)之间基因型频率和等位基因频率比较差异无统计学意义。见表2。

表2 不同年龄PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较〔n(%)〕

2.5 不同性别PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较 男性PD组与男性对照组(χ2=0.416，P=0.812和χ2=0.213，P=0.644)，女性PD组与女性对照组(χ2=0.726，P=0.696 和 χ2=0.033，P=0.857)基因型频率和等位基因频率比较差异均无统计学意义。见表3。

表3 不同性别PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较〔n(%)〕

3 讨论

近年来，随着诸多PD相关易感基因的发现，人们意识到遗传因素对PD发病所起的重要作用。LRRK2基因又名PARK8，位于染色体12q2，全长7 584个碱基，有51个外显子，是常染色体显性遗传PD中突变频率最高的致病基因，也是最常见的迟发型PD的致病基因。

LRRK2基因突变具有明显的地域和种族差异：G2019S和R1441C在欧洲和北非高加索人群中常见〔3～5〕，在亚洲的突变却非常少见，仅占LRRK2突变的0.1%左右。G2385R被报道是第一个中国人群特异的PD风险因子，由台湾的Mata等〔6〕首次发现，随后其突变研究成为热点。G2385R在马来人PD患者中突变频率为2.0%，但同PD发病无相关性，在印度及高加索等其他种族中均未检出这个多态〔7～9〕，然而在东亚各国家和地区的散发性PD患者常见该位点突变，突变频率分别为中国大陆10%，新加坡7.27%，日本11.6%，台湾8%〔10〕。R1628P是新近发现的一个突变位点，与G2385R类似，其携带者以杂合状态为主，是散发性 PD 的一个风险因素〔11〕。Ross等〔12〕报道R1628P可能是第二个中国人群特异的 PD风险因子，与G2385R不同的是，在亚洲其他种族中未发现该位点突变，是汉族人群特异性的突变位点。

S1647T是除G2385R和R1628P之外又一与中国汉族PD发生有关的多态位点。Zheng等〔1〕研究发现该位点的A等位基因增加了中国华南地区汉族人群PD的患病风险;台湾的Lin等〔2〕研究证实S1647T多态协同环境因素致使人群的PD患病增加;同时Chang等〔13〕研究结果也表明S1647T位点的突变增加了中国汉族人群PD的发病风险。目前尚未见国外学者对该位点的研究报道。

本研究结果显示，LRRK2基因S1647T多态以TT和TA基因型多见，AA基因型较少见。A等位基因频率在PD组与对照组之间无明显差异，提示A等位基因可能与新疆和田地区维族人群散发性PD遗传风险可能无关，这与国内Zheng等和Chang等文献报道的结论不同，由于LRRK2基因突变类型存在明显的种族及地域差异，新疆地区地处中亚，维吾尔族具有与汉族不同的遗传背景，所选维吾尔族研究对象均为当地居民，同内地其他地区、民族未有通婚，研究对象同质性较高，该研究结果进一步证实了LRRK2基因突变的地域和种族差异性，说明S1647T是中国汉族人群的突变热点。按年龄分组，该研究表明S1647T位点基因型频率及等位基因频率在早发PD组和≤50岁对照组、迟发PD组和＞50岁对照组、早发PD组和迟发PD组间均无统计学意义。这与Chang等〔13〕研究证明的与早发型PD有关结论不同，这与样本量不足、抽样误差以及Chang的研究对象主要来自四川有关，不同地区、种族、环境及生活习俗的差异也会造成的不同的结果。今后有必要继续扩大样本量在其他人群和民族中对该位点进行更进一步的研究。

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