水酶法提取油菜籽粕中多酚的研究

肖 頔 王承明

(华中农业大学食品科技学院，武汉 430070)

水酶法提取油菜籽粕中多酚的研究

肖 頔 王承明

(华中农业大学食品科技学院，武汉 430070)

采用水酶法和响应面设计法对菜饼粕中多酚的提取工艺进行研究。在单因素试验的基础上，选定pH、加酶量、温度和反应时间4个因素，通过响应面分析得到了优化组合条件。最佳工艺条件是:原料粒度80 目，液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量4.3%，温度 50 ℃，时间 43 min，此时菜籽多酚得率为 6.43 mg/g。

菜籽粕 多酚 提取 水酶法 响应曲面法

油菜籽是世界三大油料作物之一。我国是世界上油菜籽产量最多的国家，近年来的年产量已达到1 000万吨，提取菜籽油后，每年大约有650万吨菜籽饼粕产生［1－3］。菜籽饼粕中蛋白质含量很高，约为45%，但其中含有硫代葡萄糖苷、植酸、多酚化合物等有害及抗营养成分，因而无法作为食品级蛋白质，限制了菜籽饼粕的开发和利用［4］。大量的菜籽饼粕只能按少量比例添加到动物饲料中或用作肥料，造成了资源的极大浪费。从菜籽饼粕中把抗营养成分提取出来，具有提高菜籽饼粕使用价值和增加其附加值的重要意义。

菜籽多酚是存在于菜籽饼粕中的一类植物次生代谢产物［5］。而且菜籽粕中多酚含量高于其他油料粕，大约是大豆粕30倍［6］。目前，从菜籽饼粕中提取菜籽多酚，国内有关报道主要是采用甲醇、丙酮、乙醇等有机溶剂提取，但由于环境污染和成本等原因，这些方法不太适合工业上的应用。酶提取技术是近几年发展起来的一项重要的提取技术，通过酶反应温和地将植物组织分解，可以加速有效成分的释放和提取［7］。利用水酶法提取菜籽粕中多酚少有报道，本试验着重研究利用糖化酶提取菜籽饼粕中菜籽多酚的各个影响因素，并对其进行了工艺优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油菜籽粕:由益海嘉里(武汉)粮油工业有限公司提供;糖化酶:北京奥博星生物技术有限责任公司;一水合没食子酸标样:国药集团化学试剂有限公司;钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、磷酸、盐酸、碳酸钠和溴水为分析纯。

1.2 主要仪器

电子天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;余佳水浴锅:浙江省余姚市检测仪表厂;pH计:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;722型分光光度计:天津市普瑞斯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菜籽粕多酚含量的测定

采用 Folin－Ciolcallteu比色法［8］。

1.3.1.1 一水合没食子酸标准溶液

准确称取一水合没食子酸0.100 g，用蒸馏水溶解、定容至100 mL，此溶液质量浓度为1 000 mg/L。分别吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 到 100 mL 的瓶中，用水稀释定容。即分别得到 0、10、20、30、40、50 μg/mL的一水合没食子酸标准溶液。

1.3.1.2 标准曲线的制作

从 0、10、20、30、40、50 μg/mL 的一水合没食子酸标准溶液中分别吸取1.0 mL，分别加水5 mL，FC显色剂1.0 mL，7.5%碳酸钠溶液3 mL，此时分别相当于得到 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的一水合没食子酸。放置2 h后在765 nm下测定系列标准溶液的吸光度。以吸光度对没食子酸浓度进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.3.1.3 含量测定

将油菜籽粕多酚提取液加蒸馏水定容至100 mL，准确移取1.0 mL，按照“1.3.1.2”的方法处理样品溶液，同样测定A765，对照标准曲线计算得到多酚含量。

1.3.2 工艺流程

油菜籽粕→粉碎→过筛→水酶法提取→离心取上清→定容至100 mL→FC测定

1.3.3 单因素试验设计

油菜籽粕机械粉碎后，过80目筛，准确称取一定量的经过前处理的油菜籽粕，采用水酶法提取多酚，考察加酶量、反应时间、液料比(水:菜籽粕，mL/g)、pH、温度对多酚得率的影响。

1.3.4 响应面的组合试验设计［9］

在单因素试验的基础上，确定pH(X1)、加酶量(X2)、温度(X3)、反应时间(X4)4个因素为自变量，多酚得率为响应值，通过响应面分析及岭嵴分析对提取条件进行优化。试验因素及水平选取见表1。

表1 水酶法提取菜籽粕多酚试验的因素与水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线的回归方程为:y=0.126 8x+0.012 2，r=0.999 3。式中，x为反应体系中没食子酸含量(μg/mL)，y为反应后反应体系在765 nm下的吸光度。在0～5.0 μg/mL范围内，没食子酸含量与A765呈极显著性正相关。

2.2 水酶法提取菜籽多酚单因素试验

2.2.1 加酶量对多酚得率的影响

称取1.00 g样品，在液料比 15∶1，温度为 50℃，pH 4.0 的条件下，分别加入 1%、2% 、3% 、4% 、5%、6%糖化酶，提取时间40 min，然后离心取上清液并定容，用FC比色法测定多酚含量，结果如图1所示。

图1 加酶量对多酚得率的影响

从图1中可以看出，随着糖化酶用量的增加，多酚得率逐渐提高，酶用量达一定值后，多酚得率增加缓慢。这可能是由于底物中与酶相互作用的位点饱和，趋近于稳定，综合考虑，选择4%加酶量较合适。

2.2.2 反应时间对多酚得率的影响

称取1.00 g样品，在液料比15∶1，温度为50℃，pH 4.0，加酶量4%的条件下，提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min，离心取上清液，定容后测定菜籽多酚含量，结果如图2所示。

图2 反应时间对多酚得率的影响

由图2可知，在一定的范围内随着提取时间的延长，得率得到提高，但在40 min后得率反而有所降低。其原因可能是在长时间高温下菜籽多酚发生氧化、降解、缩合等反应，使得得率降低。因此提取时间选择40 min为宜。

2.2.3 液料比对多酚得率的影响

称取 1.00 g样品，在温度为 50 ℃，pH 4.0，加酶量4%，反应时间40 min的条件下，液料比分别为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 下提取，离心取上清液，定容后测定菜籽多酚的含量，结果如图3所示。

图3 液料比对多酚得率的影响

由图3可知，随着液料比的增加，多酚得率随之提高，但是到达了一定程度后得率反而会有降低的趋势。这可能是因为随着液料比的增大，多酚溶出增加，当液料比达到25∶1，多酚溶出基本平衡，而随着液料比的进一步增加，溶液体积加大，加大了与空气接触面从而导致部分多酚被氧化，进而多酚得率有所下降，另外增加提取液会使提取成本加大，综合考虑，液料比选取25∶1比较合理。

2.2.4 pH对多酚得率的影响

称取1.00 g样品，在温度为50℃，液料比25∶1，加酶量4% 的条件下，分别调 pH 为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，提取 40 min，离心取上清液，定容后测定菜籽多酚的含量，结果如图4所示。

图4 pH对多酚得率的影响

由图4可知，随着pH的升高，多酚得率逐步增加，pH 5.0时多酚得率最高，为较优提取条件。

2.2.5 温度对多酚得率的影响

称取1.00 g 样品，在液料比 20∶1，pH 5.0，加酶量4%的条件下，反应温度分别为 40、45、50、55、60、65℃下提取40 min，离心取上清液，定容后测定菜籽多酚的含量，结果如图5所示。

图5 温度对多酚得率的影响

由图5可知，随着温度的升高，多酚得率逐渐升高，50℃后多酚的提取效果反而下降。这可能是因为温度过高使得多酚氧化，酶的活性降低，进而引起得率下降，故选反应温度为50℃。

2.3 响应面试验结果与分析

响应面试验设计及结果见表2。

表2 水酶法提取菜籽粕多酚的响应面组合设计及结果

利用Design－Expert对表2中的试验数据进行回归拟合，得到菜籽粕多酚得率对以上4个因素的回归方程为:

Y=6.405+0.058X1+0.149X2+0.064X3+0.039X4－ 0.254X1X1+0.032X1X2+0.032X1X3－0.245X2X2+0.075X2X3－0.030X2X4－0.234X3X3+0.004X3X4－0.044X4X4

对回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型P＜0.01，表明回归模型极显著;模型的一次项X2极显著，X1、X3显著;X4不显著，各因子显著性顺序为:加酶量(X2)＞温度(X3)＞pH(X1)＞反应时间(X4);二次项 X21、X22、X23均极显著;说明各因子对响应值(提取率)的影响不是简单的线性关系。各试验因子与响应面的关系中，其因变量和全体自变量之间的关系显著，r=93.59%，说明响应值的变化有93.59%来源于所选变量，即pH、加酶量、温度、反应时间。失拟项不显著，说明拟合程度较好。整体分析来看，回归模型的拟合程度较好，可以用上述回归方程对糖化酶提取菜籽粕多酚的试验加过进行分析预测和确定最佳提取工艺条件。

表3 回归模型方差分析

由表4中可以看出，4个因素的特征值都为负，表明有极值。由SAS软件分析，得出各因素最优水平组合为:X1=0.146 3，X2=0.321 2，X3=0.201 5，X4=0.341 5，Y=6.446 0，即 pH 5.07，加酶量4.32%，温度 50.10 ℃，反应时间 43.41 min，考虑实际情况，修正提取工艺条件为:pH 5.0，加酶量4.3%，温度50℃，反应时间43 min。在此条件下重复试验4次，得平均多酚得率为6.43 mg/g，误差为0.25%，说明采用Box－Behnken试验设计寻求的最佳工艺条件可行。

表4 典型分析表

3 结论

采用Box－Behnken试验设计和响应面分析法，得到水酶法提取菜籽粕多酚的最佳工艺条件:液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量 4.3%，温度 50 ℃，时间43 min，此时多酚得率为6.43 mg/g。而在不加糖化酶，其他条件相同情况下，水提菜籽多酚得率4.89 mg/g。相比较水提法提取菜籽多酚，水酶法菜籽多酚含量提高了31.49%，并且该法条件温和，成本较低。

［1］Qiao H，Classen H L.Nutritional and physiological effects of rapeseed meal sinapine in broiler chickens and its metabolism in the digestive tract［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2003，84(14):1430 －1438

［2］陈刚，彭健，刘振利，等.中国菜籽饼粕品质特征及其影响因素研究［J］.中国粮油学报，2006，21(1):95－99

［3］何国菊，李学刚，赵海伶.菜籽饼粕中植酸新提取方法研究［J］.中国粮油学报，2004，19(1):57－60

［4］Naczk M，Amarowicz R，Sullivan A，et al.Current research developments on polyphenolics of rapeseed/canola:a review［J］.Food Chemistry，1998，62(4):489 －502

［5］阮征，邓泽元，严奉伟，等.菜籽多酚和Vc在化学模拟体系中清除超氧阴离子和羟自由基的能力［J］.核农学报，2007，21(6):602 －605

［6］Shahidi F，Naczk M.An overview of the phenolics of canola and rapesees:chenmical，sensory and nutrition significance［J］.Journal of the American Oil Chemists’Society，1992，69(9):917－924

［7］李炳奇，马彦梅.天然产物化学［M］.北京:化学工业出版社，2010:24

［8］Singleton V L，Joseph A，Rossi J.Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic－Phosphotungstic Acid Reagents［J］.American Society for Enology and Viticulture，1965，16(3):144－158

［9］费荣昌.试验设计与数据处理［M］.无锡:江南大学出版社，2001:59－63.

Study on the Aqueous Enzymatic Extraction of Polyphenol from Rapeseed Cake

Xiao DiWang Chengming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

Polyphenol is the main anti－ nutritional substance in the rapeseed meal，which has a more extensive utility in the food industry and other areas.Therefore，the reasonable application of the rapeseed protein application is limited.Aqueous enzymatic extraction of polyphenol from rapeseed meal was studied by adopting response surface methodology design.Four factors of pH value，addition of glucoamylase，temperature and reaction time were investigated on the basis of single factor test.By analyzing the response surface plots，the extraction parameters were optimized.Results showed that the optimal aqueous enzymatic extraction，namely using 4.3%glucoamylase to extract the powdered material with a particle size of 80 mesh at a liquid/material ratio of 25∶1(mL/g)with pH 5.0 under 50 ℃ for 43 min，resulted in a polyphenol yield of up to 6.43 mg/g.

rapeseed meal，polyphenol，extraction，aqueous enzymatic，response surface method

S565

A

1003－0174(2012)04－0050－05

2011－07－26

肖頔，女，1986年出生，硕士，农产品加工与贮藏

王承明，男，1964年出生，教授，博士生导师，农产品加工与贮藏，食品安全，食品化学