阿霉素与AnnexinV的偶联及其对乳腺癌细胞的杀伤作用

谢 德，华子春

(南京大学 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

阿霉素是一种蒽环类抗生素，可以治疗多种癌症，但副作用很大，希望通过与靶向分子偶联的方法，可以降低它的用药量和增加治疗效果。Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合，具有抗凝及抗炎作用，近年还发现它具有抗肿瘤作用［1］。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞会产生表面富含PS的微泡，微泡中含有可以促进肿瘤血管新生的表皮生长因子受体(EGFR)等物质。Annexin V通过阻止这些微泡与肿瘤血管上皮细胞的融合，从而抑制了肿瘤血管新生和肿瘤的生长［1］。这种微泡的产生机制不明，但从微泡的特性来看，我们推测肿瘤细胞的PS外翻应该是这种微泡形成的必经过程，并且在肿瘤组织中确有很多细胞的PS是外翻的，而正常组织细胞的表面很少有PS暴露出来。Annexin V蛋白在体内可以与PS外翻的肿瘤细胞结合［2］。以Annexin V作为靶向分子的偶联药物，目前还未见报道。本研究选择EDC/sulfo-NHS为偶联剂，将阿霉素的氨基偶联到Annexin V的羧基上［3］，对二者偶联实验条件作了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

盐酸阿霉素(CAS:25316-40-9)购自南京康满林公司;Annexin V蛋白为本实验室表达、纯化［4］;2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-NHS)购自Sigma公司;人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自中国科学院上海细胞库。

岛津UV-2550紫外可见分光光度计;Eppendorf Centrifuge 5810R离心机;TECAN SAFIRE自动酶标仪;Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪。

1.2 阿霉素与Annexin V偶联物的制备

将Annexin V冻干粉2mg溶解于含有0.05 mol/L MES、0.5 mol/L NaCl的缓冲液(pH 6.0)2mL中，加入EDC，使其终浓度在6 mmol/L，加入sulfo-NHS，使其终浓度在5～15 mmol/L，混匀后室温反应15 min。然后加入2-巯基乙醇(20 mmol/L)反应10 min，以中和未反应的偶联剂。用截留分子质量为10 kD的超滤管离心浓缩中间产物。将盐酸阿霉素3mg溶解于0.1 mol/L 磷酸钠溶液(pH 7.5)1.6mL中，再将超滤管浓缩的中间产物与阿霉素溶液混合，室温下搅拌2 h。反应后，体系中产生的沉淀用含8 mol/L尿素的0.1 mol/L磷酸钠溶液(pH 8.0)溶解。然后使用0.1 mol/L磷酸钠溶液(pH 7.5)稀释产物溶液，用超滤管超滤浓缩，重复稀释、浓缩操作4次，直至滤过液中检测不到阿霉素为止。

1.3 偶联产物的表征

以0.1 mol/L磷酸钠溶液做参比溶液，分别做偶联物、Annexin V、阿霉素、滤过液的吸收光谱分析，扫描波长范围为200～600 nm。偶联物中阿霉素的浓度根据朗伯-比尔公式计算，C阿霉素=A495/10 000，其中10 000为阿霉素在495 nm处的摩尔吸光系数［5］。Annexin V的浓度使用Bradford法测定［6］，用牛血清白蛋白溶液做标准曲线，进而得到蛋白的摩尔浓度。阿霉素与Annexin V的偶联比=C阿霉素/CAnnexin V。

1.4 MTT法测定偶联产物对MDA-MB-231细胞的毒性作用［7］

取对数生长期的培养细胞，加入适量的胰酶-EDTA溶液消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成混悬液，并稀释成1×104/mL备用。取96孔培养板，每孔加入细胞悬液(含2×103细胞)200μL。次日，为了模拟癌细胞在体内的状态，先用0.2 mmol/L的过氧化氢处理1 h，使其PS外翻，然后再加入不同浓度的偶联物、Annexin V以及阿霉素与Annexin V的混合物，每一浓度重复做4孔。同时设无细胞组作为检测时的背景。置于相应的环境下培养72 h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液25μL，继续培养4 h。吸出上清，加入DMSO 200μL，震荡15 min，用酶标仪测 A570值，存活率=(A/A0)×100%，A0为肿瘤细胞对照组吸光度值，A为药物处理组吸光度值。偶联物的药物浓度以其中含有的阿霉素的浓度为准。

2 结果

2.1 影响偶联反应的实验条件

由于盐酸阿霉素在碱性溶液中溶解度比中性或酸性溶液小，所以本实验中所用的盐酸阿霉素在磷酸钠溶液中并不能完全溶解，形成阿霉素的悬浊液，阿霉素在0.1 mol/L磷酸钠(pH 7.5)溶液中的饱和浓度为0.378 mmol/L，浓度较低，并且在反应中一直处在饱和浓度下。而从表1可以看出，在EDC过量的情况下，sulfo-NHS的浓度对产物的偶联比有着较大的影响。

表1 Sulfo-NHS浓度对偶联物偶联比的影响Tab.1 Effect of Sulfo-NHS'concentration on molar ratio of conjugate

由于阿霉素的疏水性，偶联物在生成后会形成絮状沉淀。由于在随后的细胞试验中要求偶联物必须是溶解状态的，因此，本研究采用含有8 mol/L尿素的0.1 mol/L磷酸钠溶液(pH 8.0)溶解，再用0.1 mol/L磷酸钠溶液超滤，获得了偶联物的溶液。

2.2 偶联物的吸收光谱

从吸收光谱(图1)可见，偶联物在450～550 nm波长处有一个较明显的吸收峰，是阿霉素的特征吸收峰，而在滤过液和Annexin V溶液中则没有这个吸收峰，说明阿霉素是偶联在蛋白上的。

图1 4种溶液的吸收光谱Fig.1 Spectra of four kinds of solution

2.3 MTT法检测细胞毒性

由于Annexin V是与细胞表面的PS结合，所以在给药前用0.2 mmol/L过氧化氢处理细胞1 h，使细胞处于早期凋亡的状态下，这时细胞的PS外翻，可以模拟Annexin V在体内肿瘤组织的作用。从MTT结果看，偶联物浓度为1μmol/L时，细胞存活率已经降为27.7%(偶联物的浓度以其中所含阿霉素浓度为准)，而要达到相同的抑制率，单独使用阿霉素则需要1.8μmol/L。Annexin V在高浓度时也显示了一定的肿瘤细胞杀伤作用，例如，Annexin V为3.88μmol/L时，细胞存活率为63.9%。图2是4种物质对MDA-MB-231细胞的MTT实验结果。

图2 MTT法测定MDA-MB-231细胞存活率Fig.2 MTT assay of MDA-MB-231 cell survival

3 讨论

Annexin V是一种膜联蛋白，生物信息学分析显示，它含有24个天冬氨酸，29个谷氨酸，分子表面的羧基都有可能是偶联位点，其潜在的偶联位点较多，所以用这种偶联方法的位点特异性不强，有可能会造成蛋白上的PS结合位点被封闭，影响结合活性。因此，偶联方法还有需要进一步改进之处。

通过测量阿霉素溶液的吸收光谱，计算出阿霉素在0.1 mol/L磷酸钠溶液中的饱和浓度为0.378 mmol/L，该饱和浓度较低可能是导致了偶联物偶联比低的一个可能原因。

过氧化氢是一种诱导细胞凋亡能力极强的氧化剂，本实验中使用0.2 mmol/L的浓度作用1 h后，可以观察到部分细胞变圆，呈现早期凋亡的状态。但在阴性对照组中洗去过氧化氢后，72 h以内，细胞生长正常，并没有出现大量死亡的现象，而且阴性对照组细胞MTT实验的测定的结果也表明该组细胞保持较好的活力。

肿瘤组织中不光是肿瘤细胞上的PS暴露在外表面，肿瘤血管上皮细胞也有这种现象［2］，所以，Annexin V还可以作为靶向肿瘤血管上皮细胞的分子。有研究表明阿霉素可以破坏血管上皮细胞的微结构［8］。所以，有理由推断，Annexin V与阿霉素的偶联物在肿瘤血管新生可能具有较强的靶向抑制作用，进而加强抗肿瘤效果。

［1］Al-Nedawi K，Meehan B，Kerbel R S，etal.Endothelial expression of autocrine VEGF upon the uptake of tumor-derived microvesicles containing oncogenic EGFR［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(10):3794-3799.

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［3］Hermanson G T.Bioconjugate Techniques［M］.2nd edition.London:Academic Press Inc，2008:219-223.

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