裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养基组成的优化研究

畅晓洁，郑必胜，赵 欣

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养基组成的优化研究

畅晓洁，郑必胜*，赵 欣

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

采用恒温摇床培养法培养裂褶菌，研究了裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种无机盐的单因素参数，并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析，从而确定最佳的产酶培养基配方为：葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%。

裂褶菌，内切β-1，3-葡聚糖酶，培养基组成

裂褶多糖（Schizophylluan，简称SPG）是由药用真菌裂褶菌分泌的一种中性胞外多糖，且只含有β-D-葡聚糖[1]。独特的化学结构使得它在调节免疫功能、抗肿瘤、抗辐射等方面有着显著的疗效。但天然裂褶多糖分子量大，在水中溶解度小、粘度大，若将未经降解处理的裂褶多糖用于注射治疗肿瘤疾病，会引发肌肉疼痛、血栓等问题[2]。日本学者提出在提取天然裂褶多糖时必须获得有效的“活性多糖”，即在提取过程就要对多糖进行降解或者改性[3]。研究表明，裂褶菌可产生胞外内切β-1，3-葡聚糖酶[3]，在内切β-1，3-葡聚糖酶的作用下，多聚糖苷键断裂，葡聚糖水解为寡糖或还原糖，即通过酶切来降低β-D-葡聚糖的聚合度而不改变其天然结构，不影响或降低其生物活性[4-5]。本文对裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的培养基组成进行优化，确定最佳的培养基组成，为提高裂褶菌产的内切β-1，3-葡聚糖酶活力提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.） 广东省微生物研究所；斜面种子培养基 PDA培养基；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 广东环凯生物科技公司，生化试剂；葡萄糖 分析纯，上海博奥生物科技有限公司；冰醋酸、NaAC、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、NaOH 分析纯，天津化学试剂厂；MgSO4·7H2O、KH2PO4·2H2O、尿素、NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4分析纯，广州市东红化工厂；苯酚、3，5-二硝基水杨酸 分析纯，汕头市光华化学厂；裂褶多糖 本实验室制备。

pHS-3C型pH计 上海虹益仪器；HQ45B气浴恒温摇床 中科院武汉科仪厂；HSP150生化培养箱 武汉中科仪有限公司；UV-2102PC紫外可见光分光光度计 上海UNICO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 初始产酶培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，硝酸铵0.25%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，pH7.0，121℃灭菌15min。发酵培养基：配制12°Brix麦芽汁1000mL，称取1.0g/L NH4Cl溶于其中，121℃灭菌15min[6]。

1.2.2 培养方法 从28℃下培养6d的斜面种子培养基上用接种环小心刮下孢子，用10mL无菌水洗入预先灭菌的装有30mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，置于摇床上振荡30min，即得到单孢子悬液（孢子浓度为106/mL）。

将单孢子悬液接种于100mL发酵培养基中，置于30℃，160r/min摇床上控温发酵，发酵7d后测定酶活力。

1.2.3 酶活力测定方法 以裂褶多糖为底物，采用应用最广泛的还原糖法测定β-1，3-葡聚糖酶活力。

1.2.3.1 DNS试剂的配制[7]称取10g 3，5-二硝基水杨酸于水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石酸钾钠，加入蒸馏水，使总体积至500mL左右，加热溶解后，加2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1000mL，储于棕色瓶中。

1.2.3.2 标准曲线的制作 准确称取葡萄糖100mg，用适量蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中。分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL葡萄糖液，各加水至1.0mL，加入DNS溶液1.5mL，沸水浴5min显色。冷却后用蒸馏水定容至25mL，摇匀，在520nm条件下测定吸光值，取1.5mL蒸馏水代替DNS溶液作为空白，绘制标准曲线。

1.2.3.3 裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶活力的测定 1mL NaAC-HAC缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）、1mL酶液、1mL 0.5%裂褶多糖组成反应体系，于50℃水浴振荡反应30min，沸水浴5min灭酶活，取上清液1mL用还原糖法测定酶水解液中的还原糖量（以葡萄糖计），以灭活酶作空白。

酶活力单位：在上述反应条件下，1min水解β-1，3-葡聚糖释放出1μmol葡萄糖所需的酶量，即为一个酶活力单位，以U表示。

2 结果与分析

2.1 还原糖标准曲线

图1 还原糖法标准曲线Fig.1 Standard curve of reduced sugars

2.2 内切β-1，3-葡聚糖酶活力的测定

初步设计的裂褶菌摇瓶发酵初始产酶培养基，测得其发酵液酶活U为3.52u/mL，在此基础上进行了产酶培养基的优化研究。

2.2.1 葡萄糖添加量对产酶的影响 研究表明：裂褶菌利用葡萄糖的能力高于二糖和三糖，在培养基中添加少量葡萄糖能够大幅度地提高产酶量[4]。葡萄糖的起始添加量对产酶影响很大，当添加量过低时，裂褶菌提前发生自溶现象；但添加量过高，酶会受到分解代谢阻遏。

图2 葡萄糖添加量对产酶的影响Fig.2 Effect of glucose additioin on enzyme activity

分别以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%不同添加量的葡萄糖作为碳源，研究葡萄糖的添加量对产酶的影响。从图2可知，在葡萄糖添加量较低时，发酵液酶活U随着葡萄糖添加量的增大而增大，当葡萄糖的添加量较高时，发酵液酶活U大幅度下降，说明酶受降解物阻遏明显；最适葡萄糖添加量为1.5%。

2.2.2 不同有机氮源对产酶的影响 分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素作为有机氮源，在初始产酶条件下进行发酵，研究等量的不同有机氮源对β-1，3-葡聚糖酶产量的影响。

图3 不同有机氮源对产酶的影响Fig.3 Effect of different organic nitrogenous on enzyme activity

由图3可知，以牛肉膏为唯一有机氮源的培养基所产的β-1，3-葡聚糖酶活力最高；其次是酵母膏。由于酵母膏和牛肉膏成分复杂，可能含有微生物生长需要的生长因子，从而促进了产酶。以尿素为唯一有机氮源的培养基中裂褶菌生长不好，测不到酶活力。可能是因为经过高温灭菌和发酵，尿素中的营养成分早已损失殆尽，或是因为裂褶菌属于木腐菌，尿素加入到培养基中不但在高温下会分解出游离氨，而且在菌丝生长后也会被菌丝的代谢物降解出游离氨，当培养基不能吸收氨态氮时，氨便以气态方式存在，当培养基中氨过高时，菌丝便会停止生长至死亡[8]。因此，最佳有机氮源为牛肉膏。

2.2.3 不同无机氮源对产酶的影响 确定葡萄糖的添加量和最佳有机氮源后，对无机氮源进行单因素实验。分别以NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4作为无机氮源，添加量以氮元素摩尔数相等为依据，在初始产酶条件下进行发酵。

由图4可知，不同无机氮源产酶活力大小顺序为：NH4Cl＞NH4NO3＞NH4H2PO4＞（NH4）2SO4。使用（NH4）2SO4、NH4H2PO4和NH4NO3作无机氮源时，裂褶菌生长不好，酶活也不高。可能是由于NH4+被利用后剩余的NO3-、SO42-和H2PO4-使培养基呈酸性，菌丝虽能利用但生长缓慢。用NH4Cl作无机氮源时，对生长和产酶都有明显的促进作用。因此，NH4Cl是最佳无机氮源。

图4 不同无机氮源对产酶的影响Fig.4 Effect of different inorganic nitrogenous on enzyme activity

2.2.4 MgSO4对产酶的影响 Mg2+是金属离子中较为重要的一种，它是许多酶活性中心不可缺少的一部分[9]。分别以MgSO4添加量为0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在初始条件下进行发酵。

由图5可知，改变MgSO4的添加量对裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的影响并不显著，当MgSO4添加量为0.05%时，内切β-1，3-葡聚糖酶活力略高，因此，MgSO4最适添加量为0.05%。

图5 MgSO4添加量对产酶的影响Fig.5 Effect of MgSO4on enzyme activity

2.2.5 KH2PO4对产酶的影响 磷酸盐不仅是核酸、酶和能量代谢的组成部分，也是菌丝生长中必不可少的元素。当缺乏磷源时，碳源和氮源也不能被很好地利用[10]。因此，磷酸盐的浓度对裂褶菌的生长和内切β-1，3-葡聚糖酶的产生有着较大的影响。

分别以KH2PO4添加量为0.02%、0.05%、0.1%和0.15%在初始条件下进行发酵，结果见图6。

图6 KH2PO4添加量对产酶的影响Fig.6 Effect of KH2PO4on enzyme activity

从图6可知，KH2PO4的浓度对内切β-1，3-葡聚糖酶产酶水平的影响表现出最适浓度效应。低浓度的KH2PO4有利于内切β-1，3-葡聚糖酶的产生，内切β-1，3-葡聚糖酶的产酶水平随着KH2PO4浓度的增加而升高；当KH2PO4浓度达一定值后继续升高时，内切β-1，3-葡聚糖酶活性反而降低。因此，KH2PO4最适添加量为0.05%。

2.3 正交实验

在确定了最佳碳源和最佳氮源（包括有机氮源和无机氮源）基础上，对葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl采用正交法设计实验，选用四因素三水平正交实验表L9（34）（见表2）以确定最佳培养基配方。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交实验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

根据表2结果可知，三因素对产酶影响的主次顺序为：葡萄糖＞牛肉膏＞NH4Cl。同时比较同一因素在不同水平下所对应酶活的大小，从而得到的各个因素的最优水平组合为A3B2C1，即这三个因素的添加量为葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%。

采用实验所得的最佳培养基配方，即葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，经过三次平行实验得到的酶活U分别为12.13、13.17、11.48u/mL，说明该菌株在上述培养基组合下产酶较稳定。由此确定以上优化的培养基配方为最佳产酶培养基配方。

3 结论

3.1 不同有机氮源在一定程度上均能促进酶的合成，以牛肉膏为最佳。

3.2 添加以相同摩尔数氮元素的不同无机氮源时，NH4Cl是最佳无机氮源。

3.3 MgSO4和KH2PO4对产酶的影响都不是很大，MgSO4和KH2PO4添加量均为0.05%时，产酶效果最好。

3.4 正交实验中以葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl作为优化菌株产内切β-1，3-葡聚糖酶的实验因素，发现对产酶的影响主次因素是：葡萄糖gt;牛肉膏gt;NH4Cl，从而得到裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的最佳培养基配方为：葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%。

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Study on the optimization of medium composition of endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr.

CHANG Xiao-jie，ZHENG Bi-sheng*，ZHAO Xin
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The constant shaking was used to culture Schizophyllum commune Fr.，and the different single-factor parameters of carbon，nitrogen and various salt forming the medium of endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr.was studied.At the same time，the four factors and three level orthogonal experimental was used to analyze the main factor.Finally，determining the optimum medium composition：glucose 2%，beef extract 0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%.

Schizophyllum commune Fr.；endo-β-1，3-glucanase；medium composition

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0167-04

2011－03－09 *通讯联系人

畅晓洁（1987-），女，硕士生，研究方向：糖类分离提纯新方法新技术。