微波加热在水解核桃蛋白中的研究

张兴灿，赵声兰，葛 锋，刘迪秋，韩本勇，陈 菱，陈朝银，*

（1.昆明理工大学，云南昆明650224；2.云南中医学院，云南昆明650200）

微波加热在水解核桃蛋白中的研究

张兴灿1，赵声兰2，葛 锋1，刘迪秋1，韩本勇1，陈 菱2，陈朝银1，*

（1.昆明理工大学，云南昆明650224；2.云南中医学院，云南昆明650200）

对照研究微波加热和水浴加热条件下，蛋白酶水解核桃分离蛋白的效果差别，并以水解度评价指标，确定了微波加热条件下单酶水解的最佳工艺。实验结果表明：微波加热可以大大提高核桃蛋白的水解速度，微波加热只需不到10min的时间即可达到所需的效果，而水浴加热则需要2h的反应时间，因此微波加热可以明显地缩短反应时间，同时还发现中性蛋白酶的水解效果优于木瓜蛋白酶。

微波，核桃蛋白，水解度

蛋白酶具有专一性，不同蛋白酶对同一种蛋白质底物的作用结果不同，水解产物中多肽的长度及结构组成也不同，因此水解产物中抗氧化肽的含量、组成、活性强弱不同，且不同蛋白酶水解同一底物时，因其作用位点不同，也会影响其水解速率[1]。植物蛋白酶如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等由于原料丰富，生产工艺简单，价格低廉，并且生产的核桃肽产品风味较好，应用于核桃肽的生产有着独特优势[2]。微生物蛋白酶随着工程菌的应用和发酵产酶效率的逐年提高，为大规模生产应用创造了条件，也非常适合于核桃肽的生产[3]。因酶法生产生物活性肽具有生产条件温和、安全性高、专一性较强、副产物少、价格低廉且可得到特定的活性肽等优点，其成为生产活性肽的主流方法[4]。目前对核桃蛋白酶解的研究逐渐增多，其中优化酶解工艺，寻求一种可靠高效的水解流程成为许多学者研究的课题。常规的酶解反应需要在水浴中进行，时间长，费时费力。近年来人们尝试通过使用各种物理辅助手段来缩短酶解时间，提高酶解效率。微波作为一种常用的物理辅助手段，由于环保无污染等特点，其应用范围不断扩大[1]。本实验以核桃分离蛋白为原料，以微波辅助酶解技术为手段，研究了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别在水浴加热和微波加热下水解核桃分离蛋白的效果，并确定最优化水解工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃分离蛋白 实验室自制，蛋白质含量≥75%；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司，食品级，酶活力为100000U/g；氢氧化钠 天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯；盐酸 广州东红化工厂，分析纯。

美的微波炉 佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司，MM721AAU-PW型；精密pH计 上海精密科学仪器有限公司，雷磁PHS-3C型；紫外可见光分光光度计 Amersham Biosciences，Ultrospec 2100 pro；恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司，HH-S型；电子天平 上海天平仪器厂，FA2104型。

1.2 实验方法

1.2.1 实验操作 配制一定浓度的核桃蛋白溶液，调节溶液的pH，加入一定量的酶，微波加热反应一段时间，取出沸水浴中加热使酶失活，然后按1.2.2测定核桃蛋白的水解度，并以水解度为主要指标，判定影响核桃蛋白水解主要因素的最佳水平。

1.2.2 水解度的测定 传统的水浴加热条件下，因反应时间周期较长，可以采用及时补碱液使酶解过程中pH的波动在相对理想的范围内，进而根据最后消耗的碱液量计算水解度。但是在微波加热条件下，一方面因其时间较短；另一方面，微波炉是一个封闭的环境，在反应的过程中加碱液不方便操作，因此在反应结束后补加碱液来计算水解度。酶解反应结束后加入0.05mol/L的NaOH溶液调节pH至反应溶液初始pH，依据消耗的0.05mol/L NaOH溶液的量计算水解度。

水解度的计算采用pH—Stat[5]方法，按下式计算：

式中：V（NaOH）：水解过程中消耗的NaOH量，mL；Mp：蛋白质总量；a：α氨基酸的解离度；h：每克蛋白质中肽键物质的量（取2.18）。

氨基的解离度按下式计算：

式中：pK：a氨基的解离常数，一般以7.0为平均值进行计算。

2 结果与讨论

2.1 底物浓度对水解度的影响

分别精密称取一定量的核桃蛋白溶于10mL去离子水中，配制一系列浓度的底物溶液，调节底物溶液pH至7.0（中性蛋白酶实验时调pH至8.0），然后按照酶活与底物含量之比为5000U/g，加入一定量的酶，在微波炉内反应5min后，取出于沸水浴中灭酶10min，冷却后测定水解度，并绘制底物浓度与水解度的关系图，同时做水浴加热条件下的平行实验，结果见图1。

图1 底物浓度对核桃蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of concentration of substrate on degree of hydrolysis

底物浓度对水解影响较大，当底物浓度很低时，酶与底物蛋白质分子接触几率少，生成的小分子肽产率低；但底物浓度太大时，蛋白质分子会通过疏水作用和二硫健作用，形成网状聚合体，反而降低酶解效率[6]。因此选择适当的底物浓度有利于酶水解反应的进行。

从图1中可知，微波加热下的水解效果要远远好于水浴加热，如在5%底物浓度下，木瓜蛋白酶在水浴加热条件下的水解度约为3%，而在微波加热条件下的水解度为15%，远远高于水浴加热条件下的水解效果；中性蛋白酶的水解效果则要好于木瓜蛋白酶。刚开始随着底物浓度的增加，水解度先呈上升趋势，但是在达到一定的底物浓度后，这种趋势便趋于平缓，因此出于最佳条件的选择，对于木瓜蛋白酶，最适底物浓度为5%，而中性蛋白酶为6%。

2.2 pH对水解度的影响

对于木瓜蛋白酶，配制一系列底物浓度为5%的核桃蛋白溶液；对于中性蛋白酶，配制一系列底物浓度为6%的核桃蛋白溶液，其他条件按2.1不变，考察pH对水解度的影响，结果见图2。

图2 pH对核桃蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

溶液pH是决定酶催化活性的重要参数之一。酶是一种特殊的蛋白质，其分子构象和解离状态及底物分子的解离状态会随着环境pH的变化而变化，从而影响酶分子与底物的结合和催化，因此pH过高或过低均对酶水解反应产生不利影响。从图2可知，开始阶段，随着pH的增加，水解度也随之增加，对于木瓜蛋白酶，pH7.0时水解度达最大值，pH继续增加，水解度呈下降趋势。中性蛋白酶则在pH9.0时水解度达最大值，pH继续增加，水解度呈下降趋势。从图中得知，中性蛋白酶的水解效果要远远好于木瓜蛋白酶，微波加热的水解效果则要优于水浴加热。

2.3 酶浓度对水解度的影响

对于木瓜蛋白酶，配制一系列底物浓度为5%的核桃蛋白溶液；对于中性蛋白酶，配制一系列底物浓度为6%的核桃蛋白溶液，其他条件按2.1不变，考察酶浓度对水解度的影响，结果见图3。

图3 不同蛋白酶酶浓度对核桃蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of E/S on degree of hydrolysis

在底物浓度一定时，底物的水解效率取决于酶用量，酶用量越大，酶的催化位点与蛋白分子相应位点接触几率越多，水解液中游离的氨基氮含量越高。当这些位点快全部断裂时，即使继续加入酶，肽键断裂数目增加缓慢[7]。

从图3中可知，核桃蛋白水解度随着酶浓度的升高会持续增加，但增加的速度是不一样的，在E/S低于6000U/g时，随着酶浓度的增加，核桃蛋白水解度增加的幅度较大；但当E/S高于6000U/g以后，核桃蛋白水解度增加的速度减慢。从图中同样也可以看出，微波加热的水解效果要优于水浴加热，中性蛋白酶的水解效果要远远好于木瓜蛋白酶。

2.4 反应时间与水解度的关系

对于木瓜蛋白酶在pH7.0（中性蛋白酶的条件则为pH9.0），酶用量均为E/S=6000U/g，木瓜蛋白酶的底物浓度为5%，中性蛋白酶的底物浓度为6%，考察微波作用时间对水解的影响，结果见图4。

微波加热辅助酶解蛋白质技术的最大特点是瞬时加热，使得酶促反应在短时间内迅速完成。由图4可知，当酶用量一定时，水解时间愈长，水解效果愈好，但达到一定时间后，递增速度变得缓慢。微波加热时，随着反应的进行，反应液温度持续升高，因此核桃蛋白的水解度也跟着增加，但是5min以后，反应液的温度已经过高，酶的活性受到抑制，反应速度开始减慢。对比研究图4不难看出，微波加热相对于水浴加热最大的优势就是在较短的时间内即可达到较高的水解度，利用微波加热只需5min左右的时间就可以达到水浴加热条件下200min才能达到的水解度，因此将微波加热技术应用于核桃蛋白肽的生产，可以大大提高水解速度约10～40倍。姜莉[8]采用木瓜蛋白酶水解自制的核桃蛋白，结果发现木瓜蛋白酶的水解度为9%，本实验中在微波加热条件下加热5min，水解效果即可达到15%，高于其实验效果。

图4 核桃蛋白水解度随酶解时间的变化关系曲线Fig.4 Effect of time on degree of hydrolysis

3 结论

3.1 初步确定了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对核桃蛋白的较佳水解条件分别是：木瓜蛋白酶：酶和底物之比为6000U/g，pH7.0，底物浓度为5%，水解时间为5min；中性蛋白酶：酶和底物之比为6000U/g，pH9.0，底物浓度为6%，水解时间为6min。

3.2 同等条件下中性蛋白酶的水解效果较木瓜蛋白酶好。

3.3 微波加热相对于水浴加热最大的优势是在较短的时间内就可以达到较高的水解度，利用微波加热只需5min左右的时间就可以达到水浴加热条件下200min才能达到的水解度，这对提高生产力水平具有重要意义。

[1]李菊芳，董绪燕，魏芳，等.微波/超声波及固定化酶技术在食品蛋白质高效水解中的应用研究进展[J].中国农业科技导报，2009，11（6）：86－92.

[2]张树政.酶制剂工业（下册）[M].北京：科学出版社，1986：387.

[3]郭杰炎，蔡武城.微生物酶[M].北京：科学出版社，1986：246.

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[5]袁斌，吕桂善，刘小玲.蛋白质水解度的简易测定方法[J].广西农业生物科学，2002，21（2）：113－115.

[6]李书国，陈辉，庄玉亭.复合酶法制备活性寡肽研究[J].食品与油脂，2001（3）：5－7.

[7]刘静，陈均志.微波双酶协同水解大豆分离蛋白制备小分子肽的研究[J].食品研究与开发，2006，27（8）：9－12.

[8]姜莉.核桃渣制备核桃蛋白和多肽的研究[D].陕西：西北农林科技大学，2007.

Effect of microwave on enzymolysis of walnut protein

ZHANG Xing-can1，ZHAO Sheng-lan2，GE Feng1，LIU Di-qiu1，HAN Ben-yong1，CHEN Ling2，CHEN Chao-yin1，*
（1.Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224，China；2.Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650200，China）

Papain and neutral protease were used to hydrolyze walnut protein under the condition of microwave heating and water-bath heating respectively，using degree of hydrolysis as standards，the optimized conditions of one enzymolysis were found.The results showed that microwave heating could improve efficiency of enzymolysis about tenfold to fortyfold，and neutral protease was better than papain.

microwave；walnut protein；degree of hydrolysis

TS255.6

B

1002-0306（2012）03-0252-03

2011－03－15 *通讯联系人

张兴灿（1987-），男，在读硕士，研究方向：生物技术制药。

云南省科技计划项目（2009EB081）。