莲子皮生物碱超声波辅助提取条件优化及抗氧化性研究

李 杨，周 坚，万 盈，李吉绪

（武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉430023）

莲子皮生物碱超声波辅助提取条件优化及抗氧化性研究

李 杨，周 坚*，万 盈，李吉绪

（武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉430023）

为了确定莲子皮中生物碱类物质的提取工艺和初步鉴定该类物质的活性，以生物碱得率为考察指标，采用正交实验，研究了提取时间、超声功率、乙醇浓度、液料比四个因素对生物碱类化合物提取的影响。同时，以生物碱类物质对DPPH自由基、超氧离子自由基、羟基自由基的清除率作为考察指标，研究了莲子皮生物碱的体外抗氧化活性。确定了最佳提取工艺条件为：提取时间为45min，超声功率为70W，乙醇浓度为80%，液料比25∶1。生物碱具有较强的体外抗氧化活性，对DPPH·、O2-·、·OH均具有良好的清除作用。

莲子皮，生物碱，超声波提取，抗氧化活性

莲子皮（lotusseed skins）属睡莲科莲属（Nympheaceae Nelumbo Adans）莲的种皮，其味涩，性凉，归心、脾经，具有清热利湿、收敛之功效，配车前子、木通用治湿热泄痢[1]。莲子是福建、浙江、湖南、湖北、江苏、河北等地广为流传的一种既可当做食物也可作为中药的物质，含有丰富的多糖、磷脂、生物碱和类黄酮等营养保健成分[2]。据研究，莲子心里面含有莲心碱（Liensi-nine）、异莲心（Isoliensinine）、甲基莲心（Neferine）、荷叶碱（Nu-ciferine）、前荷叶碱（Pronucifefine）、甲基紫堇杷灵（Methylcorv-palline）、去甲基乌药碱（Demethylcoclaurine）、牛角花素（Lotusine）等生物碱，它们的药用功能已有制剂用于临床[3]。近年来，国内对莲子和莲子心在多糖、生物碱、黄酮等方面的研究取得了较大的成就[4-9]，但对莲子皮功效成分的研究几乎没有，本实验采用超声波辅助提取法对莲子皮的生物碱提取工艺及体外抗氧化活性进行研究，为莲子皮活性成分的进一步研究开发奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲子皮粉末 湖北鱼米乡食品有限公司，过60目筛，水分10.56%、蛋白质21.5%、灰分5.5%；莲心碱 深圳市美荷生物科技有限公司，色谱纯；二苯代苦味酰自由基（DPPH·） sigma公司，色谱纯；水杨酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、抗坏血酸 国药集团，分析纯。

KQ2200DV型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；pH酸度计 梅特勒-托利多公司；数显恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总生物碱的提取方法[10]称取一定质量的干莲子皮粉2g，置于具塞三角锥形瓶中，加入80%的无水乙醇40mL超声提取。过滤，滤液置于蒸发皿中水浴蒸干，在残渣中加入pH=1的盐酸溶液20mL溶解，离心弃去不溶物，滤液加入氨水调节pH至9，用等量的乙醚萃取3次，合并乙醚液，用旋转蒸发器回收乙醚，残渣用无水乙醇溶解，定容至50mL，即得。

1.2.2 总生物碱得率的测定

1.2.2.1 总生物碱的紫外吸收光谱的测定 取莲心碱对照品溶液，于200～400nm波长范围内扫描，测得其在283nm波长处有最大吸收，与文献报道一致[11]，故选择283nm为最大吸收波长。在200～400nm处对样品溶液、对照品溶液进行扫描，紫外吸收光谱如图1、图2。

图1 莲心碱标样紫外吸收图谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of liensi-nine

图2 样品溶液紫外吸收图谱Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of sample

1.2.2.2 标准溶液的配制和标准曲线的制作[12]精密称取9.17mg莲心碱标准品，用乙醇溶解定容至10mL，配成浓度为0.917mg/mL的溶液。取0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90mL标准品溶液分别置于10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，溶液浓度分别为27.51、36.68、45.85、55.02、64.19、73.36、82.53μg/mL。以无水乙醇为空白，于283nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.0151C-0.0036，R2=0.9995（n=7）。

1.2.2.3 总生物碱得率的测定 取不同条件下所得莲子皮总生物碱提取液，按1.2.1方法处理后，在283nm波长处测定吸光度，根据上面得到的回归方程计算总生物碱的含量。

式中：M1：总生物碱的含量，单位为μg/mL；M：莲子皮粉的质量，单位为g。

1.2.3 超声波提取总生物碱单因素实验 先以提取时间、超声功率、乙醇浓度、液料比四个因素进行单因素实验，以确定各因子的影响效果和适宜的范围。单因素实验设计表见表1，然后根据单因素实验结果选取适当条件范围进行四因素三水平正交实验。

表1 莲子皮生物碱提取单因素设计实验Table 1 Single factor experiments for extracting alkaloid from lotus seed skins

1.2.4 正交实验设计 以单因素实验结果为参考，选用L9（34）正交实验设计表，以提取时间（A）、超声功率（B）、乙醇浓度（C）、液料比（D）为影响因素，以总生物碱得率为指标，优化提取工艺参数，从中筛选最优的工艺条件。

表2 L9（34）正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.5 生物碱的体外抗氧化活性

1.2.5.1 总生物碱清除DPPH·的能力[13-14]用无水乙醇配制40.35μg/mL的生物碱溶液，分别吸取1、1.5、2、2.5、3mL于10支具塞试管中（分2组），向其中一组加入DPPH溶液5mL，摇匀30min后在517nm波长下测吸光度，即为Ai，用无水乙醇作为参比；同时测定2.5mL DPPH溶液与2.5mL无水乙醇混合后的吸光度，即为Ac；向另一组加入无水乙醇至5mL，混合后测其吸光度，即为Aj。根据下式计算清除率：

同时用75%的乙醇配制浓度为40.35μg/mL的抗坏血酸溶液，按照上述步骤计算对DPPH自由基的清除率。

1.2.5.2 总生物碱对O2-·的清除效果[15]取50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2）4.7mL，加入5mL的蒸馏水，混匀后在25℃的水浴中保温20min，取出后立即加入于25℃预热的0.3mL的邻苯三酚溶液（用10mmol/L的HCl配制），迅速摇匀后，于325nm波长下每隔30s测定吸光度，邻苯三酚自动氧化5min后，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值△A0，用10mmol/L的HCl代替邻苯三酚做为空白。在加入邻苯三酚之前加入不同体积的40.35μg/mL的生物碱溶液，作为待测液，按照上述步骤测定每分钟吸光度的增加值△A。根据下式计算各待测物对O2-·的清除率。

1.2.5.3 总生物碱对·OH的清除效果[16-17]依次加入10mmol/L的水杨酸-无水乙醇溶液0.5mL，随后加入1、1.5、2、2.5、3mL不同体积的40.35μg/mL的生物碱溶液，再加入0.5mL 10mmol/L的FeSO4以及不同体积的蒸馏水，使总体积到5mL，混匀后加入5mL 88mol/L的H2O2，启动Fenton反应，摇匀后于510nm波长下测定吸光度即为A1；取0.5mL的蒸馏水代替浓度为10mmol/L的FeSO4，所测得的吸光度为A2；取0.5mL的蒸馏水代替生物碱溶液，所测得的吸光度为A3；根据下式计算各待测物对·OH的清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对生物碱得率的影响 本实验比较了不同超声时间对莲子皮中生物碱的提取效果，结果见图3：当提取时间在15min至45min之间时，生物碱得率提高；在45min达到最大值。随后，随着时间的延长，得率下降；60min延长至75min时，生物碱的得率达到稳定。考虑实际生产和成本等因素，选择15、30、45min作为正交提取实验的提取时间。

图3 提取时间对生物碱得率的影响Fig.3 Influences of extraction time on yield of alkaloid

2.1.2 超声功率对生物碱得率的影响 从图4可以看出，生物碱得率开始随着超声功率的增大而增大，80W时达到最大值，随后超声功率继续增大但提取率反而降低。一般来说，增大超声波功率有助于目标产物的提取，功率越大提取应越完全，但超声功率过大，很有可能破坏生物碱的结构，使其分解，这是由于超声功率过大时会产生并聚集大量的热量，导致生物碱受热分解，结构遭到破坏，从而降低生物碱的提取效果。

图4 超声功率对生物碱得率的影响Fig.4 Influences of supersonic power on yield of alkaloid

2.1.3 乙醇浓度对生物碱得率的影响 选取不同浓度乙醇提取生物碱，结果如图5所示，当溶剂浓度在50%～80%时，生物碱的得率会随着浓度的增加逐步提高，在80%达到最大，溶剂浓度增大至90%时，得率稍稍下降，因此为了节约成本选定80%左右的乙醇最合适。

图5 乙醇浓度对生物碱得率的影响Fig.5 Influences of ethanol concentration on yield of alkaloid

2.1.4 液料比对生物碱得率的影响 随着溶剂用量的增加，生物碱得率增大，但当液料比达到25∶1时，生物碱提取率最大，之后随着溶剂继续增加，生物碱得率的变化已不太明显，这是由于在水溶液用量达到一定程度时莲子皮中的生物碱已基本全部溶出，再增加溶剂用量，不但得率变化不大，还会给后续工艺增加困难。因此液料比选择25∶1左右较为合适。

图6 液料比对生物碱得率的影响Fig.6 Influences of liquid/material ratio on yield of alkaloid

2.2 生物碱提取工艺正交实验优化结果

表3 正交实验结果Table 3 Results of the orthogonal experiment

根据以上单因素的结果，莲子皮生物碱提取过程中采用L9（34）正交实验，结果见表3。

由极差分析和方差分析结果可知，液料比和提取时间对生物碱得率有显著影响，乙醇浓度和提取功率对生物碱得率无显著影响，即液料比gt;提取时间gt;溶剂浓度gt;超声功率。正交实验得到理论上的最佳提取工艺条件为：A3B2C3D3，用此工艺提取生物碱，其得率为1.68mg/g，验证了最佳提取工艺是比较理想的。

表4 正交实验方差分析表Table 4 Variance analysis of the L9（34）orthogonal experiments

2.3 生物碱体外抗氧化作用因素

2.3.1 生物碱对DPPH自由基的清除效果 结果由图7可知，生物碱和抗坏血酸浓度在4.035～10.09μg/mL范围时，随着浓度的增大，二者对DPPH·的清除率明显增大，增幅分别为86.20%和82.90%。当浓度进一步增大时，二者对DPPH·的清除率虽继续增大，但增幅不明显。当浓度达到12.11μg/mL后，生物碱的清除效果略高于抗坏血酸。由此可见，二者对DPPH·的清除效果与浓度之间存在量效关系，并且达到一定浓度后，生物碱的清除效果高于抗坏血酸，生物碱具有较好的清除DPPH·的能力。

图7 生物碱及抗坏血酸对DPPH·的清除效果Fig.7 Effect of alkaloid and ascorbic acid on DPPH·scavenging

2.3.2 生物碱对·OH和O2-·的清除效果 由表5可知，莲子皮生物碱具有十分强的清除O2-·能力，当生物碱的浓度在6.053μg/mL时，对O2-·的清除率就达到了92.03%，随着生物碱浓度的增加，清除效果越好。通过对数据进行SPSS统计分析，可以得到生物碱浓度（x，μg/mL）与清除率（y，%）的回归方程为y=0.0092x+ 0.8669，其相关系数为r=0.9798。

同时，生物碱对·OH也有一定的清除能力，清除效果也很好，生物碱的浓度在6.053μg/mL时，对·OH的清除率达到30.97%，而且清除效果随着生物碱浓度的增加而增加，通过对数据进行SPSS统计分析，可以得到生物碱浓度（x，μg/mL）与清除率（y，%）的回归方程为：y=0.0168x+0.2318，R2=0.9736。

表5 生物碱对O2-·和·OH的清除能力Table 5 Capacity of alkaloid for clearing O2-·and·OH

2.3.3 生物碱对不同自由基的清除效果实验 由图8可知，生物碱在同浓度（6.053μg/mL）条件下，对DPPH·、O2-·及·OH的清除效果是不同的，其清除率分别为72.00%、92.03%、30.97%，即清除效果依次为：O2-·＞DPPH·＞·OH。

图8 生物碱对3种自由基的清除效果Fig.8 Effect of alkaloid on three radicals

3 结论

通过正交实验，确定了莲子皮中生物碱类化合物的最佳提取条件：液料比25∶1，提取时间为45min，乙醇浓度为80%，超声功率为70W。在此工艺条件下，总生物碱得率为1.68mg/g。正交实验极差分析表明，四因素对生物碱提取的影响程度不同，其中液料比的影响最为显著，其次是提取时间，再次是乙醇浓度，而超声功率对提取的影响不大。同时，莲子皮生物碱对O2-·具有很强的清除能力，对DPPH·、·OH也都具有很好的清除能力。

因此，莲子皮生物碱是一种很好的天然抗氧化剂，本研究结果为进一步研制开发莲子皮抗氧化和降血压等功能性食品提供了一定的基础。

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Study on ultrasonic assisted extraction technology and antioxidative activity of alkaloid of lotus seed skins

LI Yang，ZHOU Jian*，WAN Ying，LI Ji-xu
（Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

In order to determine extraction process of alkaloid from lotus seed skins and authenticate the activity of the alkaloid，and by using orthogonal experiment，the influences of various parameters such as extraction time，supersonic power，ethanol concentration or liquid/material ratio on extraction efficiency were studied taking yield of alkaloid as study index.At the same time，taking clearance ability for DPPH·，O2-·and·OH as study index，its antioxidation in vitro was studied.The optimized parameters were as follows：extraction time：45min，supersonic power：70W，ethanol concentration：80%and liquid/material ratio：25∶1.The alkaloid of lotus seed skins had better antioxidation in vitro，and it had strong capacity of scavenging DPPH·，O2-·and·OH.

lotus seed skins；alkaloid；ultrasonic extraction；antioxidative activity

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0255-05

2011－03－03 *通讯联系人

李杨（1986-），女，在读研究生，主要从事粮食油脂及植物蛋白工程方面的研究。