甘氨酸与丙烯酞胺高温反应产物的细胞毒性

刘 洁，陈 芳，胡小松

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450052）

甘氨酸与丙烯酞胺高温反应产物的细胞毒性

刘 洁1，2，陈 芳1，*，胡小松1

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450052）

丙烯酰胺是食品加热过程中生成的一种具有潜在致癌性的有毒化合物，前期研究表明甘氨酸对丙烯酰胺的生成具有抑制作用。为了探明此方法的安全性，将丙烯酰胺/甘氨酸模拟体系在高温下发生反应的产物与丙烯酰胺的细胞毒性进行初步评价，应用倒置显微镜对细胞形态学观察、台盼蓝排斥实验检测细胞存活率，结果一致表明对于神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y），在低于100g/mL的浓度范围内，反应产物的毒性作用明显小于丙烯酰胺。

丙烯酰胺，甘氨酸，反应产物，细胞毒性

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是食品热加工过程中形成的一种化学污染物。AA已经被证明是一种对人体具有神经毒性的化合物，且被国际癌症机构列为2A类致癌物，动物实验表明具有生殖毒性和基因毒性[1]。2002年瑞典科学家首次报道AA在食品中广泛存在，尤其在富含碳水化合物的高温加工食品中含量极为丰富，油炸马铃薯片中甚至高达4000μg/kg[2]，远远高于世界卫生组织规定的饮用水中AA的限值0.5μg/L[3]。2002年两篇关于热加工过程中AA形成机理的文章相继在Nature杂志上发表，证明美拉德反应（Maillard reaction）是AA形成的途径[4-5]，此结论逐渐被众多研究学者证实和接受，许多研究表明食品加工过程中添加甘氨酸对丙烯酰胺有抑制作用[6-8]。本课题组前期研究确定了高温加热条件下甘氨酸在模拟体系中抑制丙烯酰胺的反应产物和反应途径[9]。甘氨酸在食品加工中能对味感起缓冲作用，增加食品的营养，并具有抗氧化和防腐作用[10]。对于富含甘氨酸的胶原蛋白，甘氨酸还有可能作为食品内源性物质抑制丙烯酰胺的环氧化作用，降低丙烯酰胺的毒性。对于甘氨酸与丙烯酰胺反应生成的新物质，需要与丙烯酰胺的毒性相比，只有毒性更小或无毒，通过添加甘氨酸抑制丙烯酰胺的生成才有实际意义。本文通过体外细胞毒性实验从细胞水平比较新产物与丙烯酰胺的细胞毒性，即通过观察细胞形态和传统的活细胞计数法来检测和比较产物与丙烯酰胺对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的毒性，既是对甘氨酸抑制丙烯酰胺方法安全性评价的基础性探索，又是明确此方法在实际食品加工中意义的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）标准品 纯度＞99.8%，美国Sigma公司；甘氨酸（Glycine，Gly） 标准品纯度≥99%，美国Amresco公司；反应产物 RP－1amp;RP－2，纯度＞97%（液相分离）；DMEM培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；台盼蓝染色剂、胰蛋白酶 美国Sigma公司；人神经母细胞瘤细胞（SH－SY5Y） 购自中国医学科学院药用植物研究所。

XDOS－1B倒置生物显微镜 重庆光电有限公司；WMV－1000微视摄像头系统 北京微视新纪元科技公司；SW－CJ－2FD双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；37℃CO2培养箱 日本SANYO公司；SZ－97自动三重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂；GR－229EX（SG）电冰箱 日本TOSHIBA公司；MLS2420/2420U全自动杀菌釜 日本SANYO公司；电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Gly与AA高温反应产物的制备 准确称取Gly和AA各8mmol，量取50mL超纯水，加入耐压反应釜中，将密闭的反应釜置于150℃油浴中加热，反应5h。反应结束时立即将反应液倒入冰水浴中的试管里，以阻止进一步的反应。应用HPLC/ESI－MS、IT－TOF和NMR，对AA/Gly模拟体系在加热条件下生成的两个稳定产物（RP－1amp;RP－2）进行分离与鉴定，确定其分别是C5H10N2O3（RP－1）和C8H15N3O4（RP－2）[11]。反应产物用半制备液相色谱分离制备，以示差折光检测器检测。液相分离条件：MP C18柱，21.5×250mm，0.45μm，0.5%甲酸水溶液洗脱，流速10mL/min，进样量100μL。每个化合物的溶液收集之后冷冻干燥成白色粉末。

1.2.2 SH－SY5Y细胞培养 SH－SY5Y细胞使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中含有100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，培养基接种于培养瓶（容量：105mL；表面积：35cm2；盖类型：普通螺旋盖）中，于含5%的CO2，温度为37℃的培养箱中培养。

1.2.3 分组 实验设计分为空白组：仅含培养液；对照组：培养液和SH－SY5Y细胞；实验组：培养液和SHSY5Y细胞，分别添加不同浓度的AA、RP－1、RP－2。

1.2.4 倒置显微镜观察细胞形态 收集对数期SHSY5Y细胞，调整细胞悬液浓度至5×104个细胞/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5%的CO2，37℃的细胞培养箱中培养24h。在96孔板的相应孔中加入100μL浓度分别为200、100、50μg/mL的RP－1，对比加入同样浓度和体积的RP－2和AA，每个浓度设3个平行孔，继续培养48h，然后在倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 细胞存活率检测 应用台盼蓝排斥实验检测不同浓度的不同样品对培养细胞存活率的影响。将SHSY5Y细胞制成细胞悬液，浓度调至5×104个细胞/mL，加入24孔细胞培养板，每孔500μL。在24孔板每孔中，加500μL用DMEM高糖培养基稀释的不同浓度的样品RP－1、RP－2、AA（100、50、25、12.5μg/mL），37℃下再培养48h。吸尽孔中细胞培养液，每孔加0.25%胰蛋白酶将孔底覆盖，37℃下作用2min，吸尽孔内胰蛋白酶，加细胞培养液500μL，吹打均匀，每孔加500μL 0.4%台盼蓝染色液，混合均匀，将染色后培养液滴入细胞计数板，稳定2min观察，计数200个细胞，分别计数染色与不染色细胞，重复三次实验。未染色的为活细胞，染色的为死细胞，死细胞呈蓝色，计算细胞存活率。

细胞存活率（%）=未染色细胞/（染色细胞数+未染色细胞数）×100%

1.2.6 统计学分析 所有数据均用（平均值±标准偏差）表示，SAS统计学软件进行方差分析，比较各样品不同浓度实验组之间及与对照组的差异，以p＜0.01为有统计学意义的差异。

2 结果与讨论

2.1 样品处理后细胞形态变化

图1 倒置显微镜下细胞形态学观察Fig.1 Cell morphology observed under inverted microscope

实验结果显示，细胞对RP－1、RP－2、AA具有不同的敏感性。对照组细胞贴壁生长良好，形态正常，边缘清晰，多角形排列呈铺路石样，细胞间结合紧密、无缝隙。观察50μg/mL组，AA作用的细胞已有部分形态发生明显改变，明显可见细胞圆缩，细胞边缘模糊，细胞间结合欠紧密。RP－1和RP－2作用的细胞形态无明显改变，细胞贴壁生长良好，尤其是RP－2作用的细胞几乎与对照组一样，RP－1作用的细胞有个别发生圆缩。对于100μg/mL组，AA作用的细胞几乎全部圆缩，完全失去原有特点，细胞数量明显减少，可见到细胞碎片。RP－1和RP－2作用的细胞，细胞贴壁生长良好，细胞边缘仍然较清晰，但可见少数细胞圆缩。在200μg/mL组中，AA作用的细胞，数量继续减少，可见悬浮死细胞，细胞碎片增多；RP－1作用的细胞多数形态发生明显改变，细胞边缘模糊，细胞圆缩，细胞间结合不紧密；RP－2作用的细胞仍然贴壁生长良好，可见少数细胞形态开始发生改变。由此可明显判断出RP－1和RP－2对细胞产生的毒性作用明显低于AA。因此，从细胞毒性上判断，添加Gly抑制AA的方法引起新安全风险的可能性较小。

2.2 样品对SH-SY5Y细胞存活率的影响

表1 不同浓度的样品作用下SH－SY5Y细胞的存活率（%）Table 1 SH－SY5Y cell survival rate with different samples concentration（%）

台盼蓝排斥实验在显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。因为细胞死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。台盼蓝染色细胞的时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，干扰计数。

结果显示，没有样品作用的对照组的细胞存活率为98.5%±0.21%。对于每个样品，细胞存活率均随着样品浓度的升高而降低。RP－1和RP－2各个浓度实验组的细胞存活率均比AA相对应实验组的细胞存活率高。暴露于AA高剂量组的细胞存活率比低剂量组的细胞存活率降低高达65%，而暴露于RP－1和RP－2高剂量组的细胞存活率比低剂量组的细胞存活率降低不足20%。当样品浓度为50μg/mL和100μg/mL时，暴露于RP－1和RP－2的细胞存活率比暴露于AA的细胞存活率高50%以上。在台盼蓝排斥实验中，对于同一样品不同浓度之间比较时，AA、RP－1、RP－2各个浓度的细胞存活率之间的差异均有统计学意义（p＜0.01）。对于同一浓度不同样品进行比较时，低浓度12.5μg/mL实验组中AA、RP－1、RP－2各组的细胞存活率之间差异无统计学意义（p＞0.01）；而在25、50、100μg/mL实验组，AA、PR－1、RP－2的细胞存活率之间的差异均有统计学意义（p＜0.01）。每个样品的不同浓度与对照组比较时，AA各实验组细胞存活率与对照组相比，只有低浓度的12.5μg/mL实验组细胞存活率与对照组之间差异无统计学意义（p＞0.01），其他实验组与对照组的差异均有统计学意义（p＜0.01）。对于RP－1和RP－2，只有高浓度的50μg/mL和100μg/mL实验组细胞存活率与对照组之间的差异有统计学意义（p＜0.01）。

3 结论

将AA/Gly模拟体系在高温下反应的产物RP－1和RP－2与AA的细胞毒性进行比较，应用倒置显微镜对细胞形态学的观察，以及台盼蓝排斥实验检测样品对细胞存活率的结果一致表明，对于SH－SY5Y细胞在低于100μg/mL的浓度范围内，RP－1和RP－2的毒性作用明显小于AA。

通过体外细胞毒性实验，从细胞水平比较RP－1和RP－2与AA的毒性，对甘氨酸在食品加工中控制AA的毒性进行了基础性探索，初步明确了甘氨酸抑制AA的方法在实际食品加工中的意义，以促进Gly抑制AA方法在食品生产加工中的应用与推广。

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The cytotoxicity of products from heating glycine and acrylamide

LIU Jie1，2，CHEN Fang1，*，HU Xiao-song1
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China）

Acrylamide is known to be a neurotoxic，genotoxic，and a potentially carcinogenic compound. Carbohydrate-rich foods which were heated or fried at high temperatures contained relatively high levels of acrylamide.Previous studies had shown that glycine could inhibit the formation of acrylamide in model systems and food matrix，and the reaction products（RP-1 and RP-2）of acrylamide elimination in model systems by glycine were obtained.Different cytotoxicity has been observed in differentiated human neuroblastoma（SHSY5Y）cells during exposure to acrylamide，RP-1 and RP-2.When the concentration of compound was less than 100μg/mL，the survival rates of cells exposure to RP-1 and RP-2 were greater than that of cells exposure to acrylamide by Trypan blue coloring method.

acrylamide；glycine；reaction products；cytotoxicity

TS201.2

A

1002-0306（2012）03-0049-03

2011－03－07 *通讯联系人

刘洁（1979－），女，博士，讲师，研究方向：食品安全。

国家自然科学基金（31071554）；国家十一五支撑计划课题（2009BADB9B07）。