超声波辅助双水相体系提取橡实仁多酚的研究

马立然，黄 亮，2，*，李安平，2，谢碧霞

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；2.粮油深加工及品质控制湖南省重点实验室，湖南长沙410004）

超声波辅助双水相体系提取橡实仁多酚的研究

马立然1，黄 亮1，2，*，李安平1，2，谢碧霞1

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；2.粮油深加工及品质控制湖南省重点实验室，湖南长沙410004）

采用超声波辅助双水相体系提取橡实仁多酚，通过单因素实验和正交实验对提取条件进行优化。结果表明：丙酮体积分数对多酚得率有显著影响，硫酸铵用量、超声时间、料液比在考察的范围内对多酚得率影响不显著；橡实仁多酚的最佳提取条件为：丙酮体积分数80%，硫酸铵用量0.16g/mL，超声时间25min，料液比（W/V）1∶45；在此条件下进行了验证实验，得到橡实仁多酚的平均得率为3.3033mg/g，RSD为0.7674%，表明提取结果稳定性极好。

双水相体系，超声提取，橡实仁，多酚

橡实是泛指除大量栽培种植板栗以外的壳斗科Fagaceae植物种子的总称[1]。壳斗科植物一般为落叶或常绿乔木，鲜为灌木。我国是世界橡子的主要产地之一[2]。橡实营养丰富，淀粉含量一般在50%以上，蛋白质、脂肪、VB含量都高于五谷，果仁碾制成的橡子粉是纯绿色食品[3]。橡实壳和橡实仁均含有多酚类物质[4-5]，具有抗氧化[6]、抑菌、抗动脉硬化、抗癌变和防治心脑血管疾病[7]等功效，已经得到越来越多人的关注和研究。传统的提取方法如溶剂浸提法，不仅提取不完全，耗时，而且溶剂浪费严重。超声波提取法具有空化效应、粉碎作用，对植物细胞有破坏现象，能使所提取物质很好地溶于溶剂中，具有提取时间短，产率高，无需加热等优点[8]。双水相萃取分离技术是一种新型的分离技术，因其分离条件温和、成相时间短、适合大规模操作、生物亲和性好等优点[9]已经被广泛应用于食品化工、重金属离子、植物有效成分的分离[10-12]。本文采用超声波辅助丙酮-硫酸铵双水相体系提取分离橡实仁中多酚，并通过正交实验对提取工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

橡实 大叶青冈，采自湖南衡山，于40℃干燥箱中干燥并粉碎通过100目筛；没食子酸、磷酸氢二钠 国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾 天津市博迪化工有限公司；酒石酸钾钠 湘中化学试剂有限公司；硫酸亚铁 广东省台山市化工厂；硫酸铵 天津市大茂化学试剂厂；丙酮 湖南汇虹试剂有限公司；无水乙醇 安徽安特生物化学有限公司；以上试剂均为分析纯。

101-型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；FZ101微型植物试样粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；AR1140电子分析天平 奥豪斯（上海）公司；R201D-Ⅱ旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司；UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司；5510E-DTH超声波清洗器 美国必能信公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚含量的测定 采用酒石酸亚铁法进行测定。

1.2.2 标准曲线的绘制 准确称取50mg没食子酸，用蒸馏水溶解，定容至100mL，摇匀，制备成0.5mg/mL的没食子酸标准溶液。用移液管分别移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水至5mL和酒石酸亚铁溶液5mL，充分混合，再加pH7.5磷酸盐缓冲液至刻度，静置15min，以试剂空白溶液作参比，在540nm处测定吸光度。以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=18.449x-0.0211，R2=0.9988（图1）。式中：y-吸光度，x-没食子酸标准液质量浓度，mg/mL。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.2.3 丙酮-硫酸铵双水相体系 丙酮-硫酸铵形成双水相体系参照文献[13-14]。在丙酮中加入硫酸铵，通过改变丙酮体积分数和盐的用量来控制双水相的形成。

1.2.4 橡实仁中多酚的提取与含量测定 准确称取1.0g橡实仁粉末于具塞锥形瓶中，加入一定量的丙酮溶液和硫酸铵形成双水相体系，浸泡30min，超声提取一定时间，趁热真空抽滤，滤液于分液漏斗中静置分层，上层丙酮相用30%乙醇定容至100mL，按照1.2.2的方法在540nm处测定吸光度，根据下式计算多酚得率。

式中：C-多酚质量浓度（mg/mL），V-提取液的体积（mL），M-样品质量（g）。

1.2.5 单因素实验

1.2.5.1 丙酮体积分数和硫酸铵用量的选择 固定料液比1∶30（g/mL），超声时间15min，分别在丙酮体积分数为50%、60%、70%，不同硫酸铵用量的条件下提取，测定吸光度，计算多酚得率。

1.2.5.2 超声时间的选择 固定料液比1∶30（g/mL），丙酮体积分数70%，硫酸铵用量0.16g/mL，分别在超声时间为5、10、15、20、25、30min的条件下提取，测定吸光度，计算多酚得率。

1.2.5.3 料液比的选择 固定超声时间25min，丙酮体积分数70%，硫酸铵用量0.16g/mL，分别在料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50的条件下提取，测定吸光度，计算多酚得率。

1.2.6 正交实验 根据单因素实验结果，选择丙酮体积分数、硫酸铵用量、超声时间、料液比为考察因素，采用四因素三水平进行正交实验，正交实验因素水平表如表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 橡实仁多酚提取工艺的单因素实验结果

2.1.1 丙酮体积分数与硫酸铵用量对多酚得率的影响 由图2可以看出，不同丙酮体积分数的双水相体系，随着硫酸铵用量的增加，多酚得率增加，当加入的硫酸铵达到一定量时，多酚得率开始下降。当丙酮体积分数分别为50%、60%、70%时，多酚得率达到最大值硫酸铵用量分别为0.22、0.18、0.16g/mL，此时，多酚得率分别为2.3856、2.4127、2.4344mg/g。

物质在双水相体系中的萃取分离行为受分配定律支配。在丙酮-硫酸铵形成的双水相体系中，上相富含丙酮，下相富含无机盐，橡实仁多酚易溶于有机溶剂，根据相似相溶原理，多酚进入富含丙酮的上相中。双水相的形成是一个丙酮与硫酸铵争夺水分子的过程。当加入的丙酮量小时，分相所需硫酸铵的量较大。随着硫酸铵浓度进一步增加，盐对水的束缚能力增强，夺取了水分子，丙酮被释放出来，从而使上相中丙酮的体积分数增加，下相中丙酮的体积分数减少，进而影响到上相的极性，必然影响到多酚在上相中的分配。由图2可知，选取丙酮体积分数为70%，硫酸铵用量为0.16g/mL为最佳提取条件。

图2 不同丙酮体积分数和（NH4）2SO4用量对多酚得率的影响Fig.2 Effect of amount of（NH4）2SO4on the yield of polyphenols in different acetone concentration

2.1.2 超声时间对多酚得率的影响 由图3可以看出：多酚得率随着时间延长而增大，这是因为超声时间延长，可以使多酚充分地溶解到丙酮相中。达到25min时达到最大值，说明多酚已溶解完全，超过25min后多酚得率下降，可能是由于多酚的不稳定性，在氧气和光照条件下发生氧化、聚合等反应导致多酚得率下降。因此，提取时间不宜过长，选择25min为最适宜超声时间。

图3 超声时间对多酚得率的影响Fig.3 Effect of length of extraction time on the yield of polyphenols

2.1.3 料液比对多酚得率的影响 由图4可以看出：随着料液比的增加，多酚得率逐渐上升，在料液比1∶40时达到最大值，随后下降。可能是由于随着料液比的增加，其他可以溶于丙酮的成分溶出，影响到了测定结果。同时，料液比过大造成溶剂的浪费，也给后续的浓缩纯化等工作带来困难。因此选择料液比1∶40为最佳提取料液比。

图4 料液比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols

2.2 正交实验优化提取工艺的结果与分析

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

在单因素实验基础上，设计L9（34）的正交实验，统计分析得到的数据，通过极差和方差分析确定橡实仁多酚的最佳提取条件，结果见表2和表3。

表3 橡实仁多酚正交实验结果方差分析表Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiment for polyphenols of acorn seed

由表2和表3可以看出，极差R值：RA＞RC＞RD＞RB，影响橡实仁多酚得率因素主次顺序为A＞C＞D＞B，即丙酮体积分数对多酚得率影响最大，超声提取时间次之，其次是料液比，硫酸铵用量对多酚得率影响最小；丙酮体积分数对多酚得率有显著性差异，其他因素在考察范围内影响较小。

综合极差分析和方差分析得出，橡实仁多酚提取的最佳工艺组合是A3B2C2D3，即丙酮体积分数80%、硫酸铵用量0.16g/mL，超声时间25min，料液比（W/V）1∶45，橡实仁多酚得率为3.3033mg/g。

2.3 验证实验

为了检验正交实验所得出结果的可靠性，采用上述最佳提取条件A3B2C2D3进行提取实验，做三次平行，多酚得率分别为3.2799、3.3015、3.3286mg/g，多酚平均得率为3.3033mg/g，相对标准偏差RSD（Relative Standard Deviation）为0.7674%，表明优化得到的最佳提取工艺参数可靠和准确，具有可行性和参考应用价值。

3 结论

3.1 本实验考察了丙酮体积分数、硫酸铵用量、超声时间、料液比对多酚得率的影响，通过正交实验的数据处理可知，丙酮体积分数对多酚得率的影响有显著性差异，其他因素在考察的范围内对多酚得率影响较小。各因素对多酚得率的影响主次顺序为丙酮体积分数＞超声时间＞料液比＞硫酸铵用量。

3.2 超声波辅助双水相体系提取橡实仁多酚的最佳工艺条件为：丙酮体积分数80%，硫酸铵用量0.16g/mL，超声时间25min，料液比（W/V）1∶45，在此条件下橡实仁多酚的平均得率为3.3033mg/g。

3.3 本实验采用超声波辅助双水相体系提取多酚，可缩短提取时间，提取效果好，提取率高，条件温和，可以获得高活性的生物活性物质。并且多酚在丙酮-硫酸铵双水相体系中分配于丙酮相中，其他水溶性杂质等则分配于盐水相中，在提取的同时达到了多酚与杂质的分离，有效地提高了纯度。因此，在天然产物活性成分的提取分离领域具有良好的应用前景。

[1]胡芳名，李建安.湖南省主要橡子资源综合开发利用的研究[J].中南林学院学报，2000，20（4）：41-45.

[2]白坤，赵智星，景晓辉.橡子资源的开发和产品加工技术[J].现代商贸工业，2000（5）：50-51.

[3]魏练平，毛非鸿，蒋立科，等.橡子营养成分及其加工利用的初步研究[J].安徽农学通报，2007，13（9）：137.

[4]郑菲，黄亮，李安平，等.响应面法优化橡实壳中多酚提取工艺条件[J].食品与机械，2011（1）：49-51.

[5]谢碧霞，谢涛.我国橡实资源的开发利用[J].中南林学院学报，2002，22（3）：37-41.

[6]Chiou J W.The antioxdant activity and the chemical structure of sclected components of acorns and their potential use as inhibitors of milk oxidation[J].Diss Abstr Int B，1990，50（11）：4836.

[7]张志健，王勇.我国橡子资源开发利用现状与对策[J].氨基酸和生物资源，2009，31（3）：10-14.

[8]Guo X W.A method to extract chemical components from Chinese herbs-ultrasonic method[J].Natural Product Research and Development，1999，11（3）：37-40.

[9]Josefine P，Hansolof J.Aqueous polymer two-phase systems formed by new thermoseparating polymers[J].Bioseparation，2000（9）：105-116.

[10]Vania G L，Aparecida B M，Igorgose B S，et al.Separation of Cd and Ni from Ni-Cd batteries by an environmentally safe methodology employing aqueous two-phase systems[J].Journal of Power Sources，2009，193：908-913.

[11]Chethanas S，Chetan A N，Raghavarao KSMS.Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains [J].Journal of Food Engineering，2007，81：679-687.

[12]江咏，李晓玺，李琳，等.双水相萃取技术的研究进展及应用[J].食品工业科技，2007，28（10）：235-238.

[13]高强，崔岩岩，陈火林，等.丙酮-硫酸铵双水相体系分离纯化红花红色素[J].化学研究与应用，2007，19（6）：679-682.

[14]王志华，马会民，马泉莉，等.双水相萃取体系的研究[J].应用化学，2001，18（3）：173-175.

Study on the extraction of polyphenols from acorn seed using ultrasound-assisted two-phase aqueous system

MA Li-ran1，HUANG Liang1，2，*，LI An-ping1，2，XIE Bi-xia1
（1.College of Food Science and Energy，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Deeply Processing and Quality Control of Cereals and Oils，Changsha 410004，China）

Polyphenols from acorn seed was extracted by ultrasound-assisted two-phase aqueous system and through one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods to optimize extracting condition.The results indicated that acetone concentration had significant influence on the yield of polyphenols，the influence of amount of（NH4）2SO4and ultrasonic time and material-solvent ratio on the yield of polyphenols wasn't significant under the test range.The optimum conditions for the extraction of polyphenols were as follows，acetone concentration 80%，amount of（NH4）2SO40.16g/mL，ultrasonic time 25min，material-solvent ratio 1∶45（W/V）. Under the optimum conditions，through duplicated experiment the yield of polyphenols was 3.3033mg，RSD was 0.7674%，it indicated that the extraction rate of polyphenols was extremely stable.

two-phase aqueous system；ultrasonic extraction；acorn seed；polyphenols

TS201.2

B

1002-0306（2012）03-0191-04

2011－05－03 *通讯联系人

马立然（1983-），女，硕士，研究方向：食品科学。

国家林业科技公益项目（200804033）。