响应面法优化花椒香气成分的HS-SPME萃取条件的研究

李 倩，蒲 彪

(四川农业大学食品学院，四川雅安625014)

响应面法优化花椒香气成分的HS-SPME萃取条件的研究

李 倩1，蒲 彪2，*

(四川农业大学食品学院，四川雅安625014)

为了优化花椒香气成分HS－SPME萃取，在单因素实验的基础上，利用Box－Benhnken的中心组合实验设计原理，以提取物质的质(色)谱图总峰面积为考察指标，对萃取温度、萃取时间、原料用量进行3因素3水平响应面分析。结果表明，萃取温度对总峰面积有显著影响，萃取时间和原料用量对其影响不显著;萃取时间和原料用量的交互作用显著，其它交互作用均不显著;得到萃取花椒香气成分最佳的工艺条件为:萃取温度55.97℃，萃取时间30.73min，原料用量3.15g，在此条件下，香气成分总峰面积为2.21101×109。

花椒，顶空固相微萃取，香气成分，响应面分析，中心组合设计

花椒是指芸香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)和青椒(Zanthoxylum schinlfolium Sieb et Zucc)的干燥成熟果皮［1］，是我国特有的一种香辛料。目前，对花椒的研究主要集中在以下几个方面:花椒种植与栽培及病虫害防治研究、花椒主要化学成分及含量、花椒的药理研究等。作为一种传统的香辛料，我国对花椒的良种选育及加工产品开发相对滞后，而对其发香机理、香气成分的组成与变化等的理论研究也十分有限。我国的花椒资源丰富，对其香气进行研究可以为花椒精深加工提供理论依据，创造更大的经济价值。目前，花椒香气物质的提取方法主要有水蒸气蒸馏法［2］、溶剂萃取法［3］、超临界CO2萃取法［4］、同时蒸馏萃取法［5］。固相微萃取法在花椒香气的萃取中还未见报道。固相微萃取法无需有机溶剂，分析样品量少，克服了以上几种预处理方法的缺点，操作简单、快速，费用低，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，能够尽可能地减少被分析的香气物质的损失［6］。因此本实验采用固相微萃取法萃取花椒香气。响应面法(response surface methodology，RSM)是20世纪90年代初兴起的一种实验统计方法。它囊括了实验设计、建模、检验模型的合适性，寻求最佳组合条件等众多实验和统计技术。通过对方程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制，可方便地求出相应于各因素水平的响应值［7］。本研究在单因素实验的基础上，选取萃取温度、萃取时间及原料用量为影响因素，以萃取物质离子色谱图峰面积为考察指标，对顶空固相微萃取花椒香气成分的条件进行优化，以达到最佳萃取效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四川洪雅青花椒 7月中旬采摘于四川省洪雅县洪川镇共同村老朱山，采摘后的青花椒装在透气的泡沫箱子里，一层花椒一层叶，用空调车运送至实验室;无水乙醚 AR，四川西陇化工有限公司。

100μmPDMS萃取头、手动 SPME进样手柄、15mL带硅橡胶垫的样品瓶 美国Supelco公司;岛津GCMS－QP2010Puls气质联用仪、岛津GC－2010气相色谱仪 日本岛津公司;DHG－9245A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;BT－124S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司; FW100高速万能粉碎机，40目筛网。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料预处理 将青花椒去梗、去杂质，置于50℃的烘箱中干燥，干燥后青花椒置于粉碎机中粉碎并过40目筛，备用。

1.2.2 萃取头老化 将首次使用的100μm PDMS固相微萃头在气相色谱的进样口老化至无杂峰，老化温度250℃，时间1h。以后每次使用前均在此温度下老化30min。

1.2.3 萃取方法 将花椒原料烘干粉碎过40目，称取一定量的花椒粉末置于15mL的样品瓶中，在预先设定好温度的水浴中保温10min，将老化好的固相微萃取针插入样品瓶中大约1cm处(不要接触到样品，以免污染针头)，推出萃取头，在设定温度下顶空吸附预制时间，收进萃取头后，拔出针头，迅速置于插入气相进样口(另外萃取头每次插入衬管的长度需保持不变，一般可利用固相微萃取自带的橡胶圈将针头伸出长度固定到1.5cm左右，确保实验的可重复性)，250℃下解析5min。

1.2.4 GC－MS检测条件 GC条件:DB－5MS毛细管柱(30m×0.25μm×0.25nm);进样口温度240℃;程序升温:50℃持续3min，以2℃/min升至70℃，再以1℃/min升至 90℃持续 2min，再以 2℃/min升至150℃，最后以5℃/min升至250℃持续10min;载气:高纯氦气，流量1mL/min，分流比40∶1;检测器:氢火焰离子检测器(FID);燃气:H2，流量50mL/min;助燃气:空气，500mL/min。

MS条件:EI+离子源;离子能量70eV;灯丝电流量0.20mA;离子源温度230℃;接口温度240℃;扫描质量范围10～500amu。

1.2.5 数据分析 数据收集用化学工作站软件对照NIST library谱库进行，成分先由谱库初步鉴定，然后积分得到总峰面积。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验设计

1.3.1.1 萃取温度的确定 将原料用量和萃取时间固定，按照1.2.3方法分别在30、40、50、60、70℃的水浴温度下萃取，通过比较GC/MS中总峰面积来确定最佳的萃取温度。

1.3.1.2 萃取时间的确定 将原料用量和萃取时间固定，按照1.2.3方法分别萃取10、20、30、40、50min。通过比较GC/MS中总峰面积来确定最佳的萃取时间。

1.3.1.3 原料用量的确定 将萃取温度和萃取时间固定，称取1、2、3、4、5g的花椒粉末置于15mL的样品瓶中，按照1.2.3方法进行萃取。通过比较GC/MS总峰面积来确定最佳的原料用量。

1.3.2 响应面实验 在单因素实验基础上，采用Box－Behnken中心组合设计原理，对影响响应值(总峰面积)的3个因素原料用量(X1)、萃取温度(X2)、萃取时间(X3)进行考察，设计因素水平编码表见表1。所得实验结果采用Design Expert7.1.3软件进行分析。

1.3.3 验证实验 将通过Design Expert7.1.3软件分析所得萃取花椒香气成分的最佳参数条件，按照

1.2.3 方法进行实验验证。

2 结果与分析

2.1 单因素对总峰面积的影响

2.1.1 萃取温度对总峰面积的影响 在固相微萃取中，当基质为固态时，温度是影响平衡的最主要因素。萃取温度对SPME的影响具有双重效应:通过升高温度，可以加快分子热运动，提高分子扩散速度(提高分析物在顶空的分配)，缩短平衡时间、加快分析速度，尤其对于顶空固相微萃取;但温度过高会使分析物在涂层与基质中的分配系数降低，涂层对分析物的吸附量减小，从而影响SPME的灵敏度［8］。同时由于很多风味物质都是热化学性质不稳定的化合物，当萃取温度过高时，易发生化学变化，例如萃取头固有组分的解析等，从而降低了萃取头的吸附分析组分的能力，导致分析结果失真。因此，萃取温度在固相微萃取过程中起到的两方面作用均应被考虑。

由图1可以看出，随着温度的升高，吸附量逐渐上升，当萃取温度50℃时，所检测的总峰面积达到最大，随着温度的继续上升，吸附量呈逐渐下降的趋势。当萃取温度30℃时所检测到的总峰面积较小，这是由于温度较低时不利于风味化合物的挥发，顶空中的化合物的量较少，而加热能提高各物质特别是低挥发性成分物质在顶空中的浓度;随着温度的升高，顶空各物质的浓度也有所提高，当到达50℃时，萃取化合物的量达到最大;但由于萃取头的吸附反应是一个放热的过程，温度升高在提高顶空各物质的浓度的同时也降低了涂层的分配系数，特别是易挥发性的小分子的分配系数，故在温度达到60℃时，萃取头的吸附效果有所下降;在温度继续升高到70℃时，萃取头的吸附效果明显变差，这可能是由于温度升高导致固体花椒粉末中水分在纤维头上凝结成水滴，从而大大降低了萃取头对化合物的吸附，同时由于许多风味物质都是热化学性质不稳定的化合物，在温度升高时，这些化合物易发生化学变化，产生后生产物，导致分析结果的失真。综合考虑诸多因素，选用50℃的温度较合适。

2.1.2 萃取时间对总峰面积的影响 不同的样品到达萃取平衡的时间是不同的，所以存在吸附与解吸附平衡的最佳时间。影响萃取时间的因素主要有萃取头的选择、分配系数、样品的扩散系数、顶空体积、样品萃取的温度等。萃取开始时萃取头固定相中物质的浓度增加很快，接近平衡时速度就极其缓慢，但在平衡之前萃取头涂层中吸附的物质量与其最终浓度就已存在一个比例关系，所以在接近平衡时就可以完成萃取过程［9］。

图1 萃取温度对总峰面积的影响Fig.1 Effects of extraction temperature on the peak area

由图2可以看出，随着时间的延长，吸附量逐渐上升，当萃取时间为30min时，所检测的总峰面积达到最大，随着时间的继续延长，吸附量呈逐渐下降的趋势。当萃取时间为10min时，萃取头的吸附－解析还没有达到平衡状态，所检测到的峰面积较小;当萃取时间为30min时，总峰面积最大;但随着时间的继续延长到40min后，由于萃取时间过长会导致萃取头固有组分的流失，导致萃取能力下降，吸附的量反而降低。表明总峰面积受萃取时间的影响，并且萃取时间应该有一个最佳值存在。综合考虑选择萃取的时间为30min较为合适。

图2 萃取时间对总峰面积的影响Fig.2 Effects of extraction time on the peak area

2.1.3 原料用量对总峰面积的影响 对于顶空萃取法，组分的萃取量与该组分在基质及萃取头涂层之间的分配系数有关［10］。试样量增大，重现性变好，检出量也随之提高。但是当萃取容器体积一定时，同一浓度的样品体积增加，会使相应的顶空体积减少，萃取量随着顶空体积与样品体积比例的减少呈现先增加后降低的趋势，因而顶空萃取时存在一个适宜的顶空－样品体积。

由图3可以看出，随着原料用量的增加，吸附量逐渐上升，原料用量为3g时，所检测的总峰面积达到最大，随着原料用量的继续增加，吸附量呈逐渐下降的趋势。表明总峰面积受原料用量的影响，并且原料用量应该有一个最佳值存在，根据图3选择原料用量为3g。

图3 原料用量对总峰面积的影响Fig.3 Effects of extraction sampling volume on the peak area

2.2 响应面法优化萃取条件得到最大总峰面积

2.2.1 响应面法因素水平及实验方案 实验设计及结果见表2。

表2 Box－Behnken实验设计及结果Table 2 Box－Behnken design and results

实验共有15个实验点，实验号1～12是析因实验点，实验号13～15是零实验点，其中析因点为自变量在X1、X2、X3所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差［11］。

2.2.2 香气成分提取工艺模型建立及其显著性检验利用Design Expert软件，对表2的实验数据进行二次多项式回归拟合，得到二次多元回归方程如下:

对模型进行方差分析，结果见表3。由表3可以看出:模型F=19.28，P=0.0023＜0.01表明模型是高度显著的;失拟项F=6.28，P=0.1404＞0.05，说明模型失拟度不显著;模型的调整系数=0.9216，说明该模型能解释92.16%响应值的变化，因而拟合度良好，实验误差小，可以用于SPME萃取条件优化的理论预测。对模型进行回归方程系数显著性检验可知:一次项X1萃取温度极为显著，其他两项均不显著;交互项X2X3显著;平方项显著，均极显著。因此各个因素对总峰面积的影响不是简单的线性关系。各因素影响大小排序依次为:萃取温度＞原料用量＞萃取时间，即X1＞X3＞X2。

依据方差分析结果，剔除不显著项，简化后的回归方程为:

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

2.2.3 响应面分析及优化 各因素间交互作用对总峰面积的响应面分析［12－13］通过Design Expert 7.1.6软件实现。根据回归分析结果作出响应曲面，见图4～图6。

图4 萃取温度(X1)和萃取时间(X2)交互作用的响应面Fig.4 Response surface graph of total peak area as a function of extraction temperature and extraction time

图5 萃取温度(X1)和原料用量(X3)交互作用的响应面图Fig.5 Response surface graph of total peak area as a function of extraction temperature and sampling volume

图6 萃取时间(X2)和原料用量(X3)交互作用的响应面图Fig.6 Response surface graph of total peak area as a function of extraction time and sampling volume

由图4可知，在因素所考察的范围内总峰面积随着萃取温度的增加呈现先增大后减小的趋势，萃取温度为55℃左右为转折点;随萃取时间的增加亦呈现先增大后减小的关系，转折点为30℃左右。由图5、图6可知，萃取温度和萃取原料用量、萃取时间和原料用量对总峰面积的影响均呈现先增加后减小的关系，且原料用量的最大值出现在3g左右。

由Design－Expert软件分析得到的最大响应值(Y)时对应的编码值分别为Xl=55.97，X2=30.73，X3=3.15，此时Y=2.21101×109;转化为实际参数，即在萃取温度55.97℃，萃取时间30.73min，原料用量3.15g，总峰面积高达2.21101×109。

为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化萃取条件进行HS－SPME萃取青花椒香气，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为:萃取温度56℃，萃取时间31min，原料用量3g。在此条件下提取3次，实际测得的平均总峰面积为2.19901×109，实测值是理论值的99.46%。因此，实验结果表明此萃取条件是可行的。

3 结论

3.1 采用实验设计软件 Design Expert 7.1.6，通过Box－Behnken中心组合实验设计得到了总峰面积与萃取时间、萃取温度、原料用量的回归模型，方差分析结果表明该模型极显著，校正确定系数达0.9216，失拟项不显著，说明该方程能很好的预测HS－SPME萃取花椒香气总峰面积随各参数变化的规律。

3.2 利用模型的响应面及等高线，对影响HS－SPME萃取花椒香气成分的关键因素及其相互作用进行探讨，得到的优化工艺参数为:萃取温度55.97℃，萃取时间30.73min，原料用量3.15g。考虑到操作的便利，对此条件进行适当修正后，实际测得的平均总峰面积为2.19901×109，实测值是理论值的99.46%。因此，用响应面分析方法对HS－SPME萃取花椒香气的工艺进行优化，可以获得最优的工艺参数，有效地减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的实验研究奠定理论基础。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.第二分册.北京:科学出版社，1997，43:13－53.

［2］赵志峰，雷鸣，雷绍荣.两种四川花椒挥发油的成分分析［J］.中国调味品，2004(10):39－42.

［3］董继生，赵全，等.花椒油萃取回流工艺的研究［J］.中国调味品，2006(8):8－11.

［4］霍文兰.超临界CO2萃取花椒挥发油的研究［J］.食品科学，2005，26(8):153－155.

［5］赵丽娟，辛广，张捷丽.两种方法提取太行山地区花椒中挥发油化学成分的气相色谱－质谱分析［J］.食品科学，2007，28(11):420－423.

［6］李大鹏，王明林，等.顶空固相微萃取分析苹果醋类香气［J］.食品与发酵工业，2010(3):150－152.

［7］李钊，王娜妮，陈栓虎.响应面优化法研究花椒籽油在近临界水中的水解中［J］.中国油脂，2009，34(5):28－31.

［8］李国栋，孙宗保，等.利用响应面法优化HS－SPME镇江香醋香气成分的条件［J］.中国酿造，2009(8):45－48.

［9］刘源，周光宏，徐幸莲.固相微萃取及其在食品分析中的应用［J］.食品与发酵工业，2003，29(7):84－87.

［10］彭帮柱，岳田利，袁亚宏.固相微萃取技术及其在酒类风味成分分析上的应用［J］.食品科学，2006，27(8):266－270.

［11］蒙哥马利DC.实验设计与分析［M］.汪仁宫，陈荣昭，译.第3版.北京:中国统计出版社，1998:621－622.

［12］杨文雄，高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用［J］.中国食品添加剂，:2005(2):68－71.

［13］OZCAN S，JACKSON D S.A response surface analysis of commercial coin starch annealing［J］.Cereal Chemistry，2003，80: 241－243.

Optimization of component HS－SPME extraction from Zanthoxylum bumgeanum Maxim by response surface methodology

LI Qian1，PU Biao2，*
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

For optimization of component extraction from Zanthoxylum bumgeanum Maxim，the extraction conditions were investigated by using single factor and response surface methodology based on Box－Benhnken central design principles，in which the total peak area of extract mass spectrum was used as response value.The results showed that significant effects were detected through extraction temperature，the interaction of the extraction time and sampling volume.The optimum conditions were as follows:extraction temperature 55.97℃，extraction time 30.73min and sampling volume 3.15g，under this condition，the total peak area was 2.21101×109.

Zanthoxylum bumgeanum Maxim;HS－SPME;aroma component;response surface methodology; central composite design

TS264.3

B

1002－0306(2012)02－0334－05

2011－03－21 *通讯联系人

李倩(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品微生物与发酵。