温度对酸乳中乳酸菌胞外多糖作用机制的研究

杨同香，王 芳，李全阳

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

温度对酸乳中乳酸菌胞外多糖作用机制的研究

杨同香，王 芳，李全阳*

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

重点探讨了不同发酵温度下酸乳发酵产生的胞外多糖含量变化以及添加不同来源的胞外多糖对酸乳流变学特性的作用，结果表明：37℃条件下发酵所得酸乳多糖含量最高，达到461.4mg/mL，43℃条件下酸乳多糖含量最低，仅为247.6mg/mL。酸乳产生的内源性胞外多糖表现在产品特性上，其表观黏度及剪切应力随时间的变化都明显（P＜0.05）高于外源添加胞外多糖的酸乳。表观黏度随剪切时间的变化曲线符合对数函数y=kLn（x）+b（内、外源R2分别为0.9527、0.9015）的变化规律。此外，酸乳经过发酵产生内源性胞外多糖后，其持水力（WHC）较添加外源性胞外多糖的酸乳高出26%，胶体脱水收缩作用敏感性（STS）较添加外源性胞外多糖的酸乳低46%。这说明低温有利于乳酸菌胞外多糖形成，且内源性胞外多糖酸乳的表观黏度大、持水力高。

酸乳，发酵温度，胞外多糖，流变学特性

酸乳制作过程中，有些乳酸菌菌株在发酵产酸的同时还产生粘性成分——胞外多糖。这些成分能够对酸乳的黏度、粘弹性、凝聚性、结构和质地等产生显著的影响[1]，因此引起许多学者和企业的极大兴趣。Milena Corredig[2]等对乳酸菌胞外多糖与蛋白质相互作用进行了综述；Maude Girard[3]等采用滴定法和离心法研究了五种带阴离子胞外多糖和牛奶蛋白质的相互作用；Ayala-Hernandez[4-5]等研究了乳酸乳球菌产胞外多糖与牛奶蛋白之间的相互作用，以及pH和中间产物对胞外多糖与牛乳蛋白相互作用和流变学特性的影响。这些研究者从不同的角度（如pH）揭示并阐释了乳酸菌胞外多糖与蛋白质之间的相互作用，但未就温度与乳酸菌胞外多糖的作用机理进行研究。孙健[6]研究了酸奶储存温度对其品质的影响；Lin[7]等研究了37℃发酵酸乳的发酵时间对乳酸菌胞外多糖含量的影响；马艳[8]等研究了高产胞外多糖湿热链球菌混菌的培养温度对酸乳胞外多糖含量影响，由此看来，在各种影响因素中，温度发挥着非常重要的作用。但是，目前均未发现针对发酵温度对酸乳乳酸菌胞外多糖的作用机制的相关报道。因此，有必要对温度与胞外多糖的影响作用机制进一步深入研究。作者前期研究发现，酸乳在添加增稠剂后，其黏度反而下降，且有乳清析出现象[9]，随后通过一系列实验，探索并表征了现象背后的作用机制[10-12]，同时温度对乳酸菌胞外多糖的产生具有非同寻常的影响作用，为此，本研究则着重探讨温度对乳酸菌胞外多糖产量的影响以及添加不同来源的胞外多糖对酸乳流变学特性的影响，以期丰富和深化乳酸菌胞外多糖的形成及其对酸乳特性的影响作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、粘性嗜热链球菌（Ropy streptococcus thermophilus） 由广西大学轻工与食品工程学院保藏；牛奶 购自南宁市农大牛奶厂；脱脂奶粉 购自伊利实业集团股份有限公司；SephacrylS-300等 购自GE公司；无水乙醇、三氯乙酸、氢氧化钠、乙醚、丙酮等 均为国产分析纯。

高速离心机 Bekman公司；UV-1601紫外分光光度计 日本SHIMADZU公司；DV-Ⅲ流变仪 美国BROOK FIELD。

1.2 实验方法

1.2.1 酸乳制备工艺 农大牛奶→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→后熟

所用的菌种为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种（1∶1），接种量为3%接种后分装，分别在37、40、43℃条件下发酵，当酸度达到80°T时取出，放入4℃的冰箱中后熟24h。

1.2.2 内源性胞外多糖（EPS）的制备 内源性胞外多糖由粘性保加利亚菌株发酵复原脱脂乳制成。

1.2.3 外源性胞外多糖（EPS）的制备 普通保加利亚菌株发酵酸乳→钝化→蒸发浓缩→乙醇沉淀→水溶解沉淀→加三氯乙酸去蛋白→透析→浓缩→乙醇沉淀→脱水→粗胞外多糖

将从不同温度下发酵酸乳得到的粗胞外多糖样品溶于0.05mol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中，用SephacrylS-300凝胶柱层析，0.05mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液洗脱，胞外多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法。

1.2.4 胶体脱水收缩作用敏感性（STS）的测定 在4℃下，将含内源性EPS、外源性EPS的发酵酸乳50g置入带有120目不锈钢丝网的漏斗中，用烧杯收集沥出的乳清[13]。收集时间为2h，每个样品取3个平行。

STS（%）=（乳清析出量/样品质量）×100%

1.2.5 持水力（WHC）的测定 在10℃下，将含内源性EPS、外源性EPS的发酵酸乳15g放入离心管中，3000r/min离心30min[14]。每个样品取3个平行。

WHC（%）=（离心后沉淀的质量/样品质量）×100%

1.2.6 黏度的测定[15]采用DV-Ⅲ流变仪，测定条件：转子转速为0～224r/min，先升速后降速，时间间隔为8s。

1.2.7 触变环的测定 采用DV-Ⅲ流变仪，测定条件：转子转速为0～224r/min，先升速后降速，升速/降速的频率为16r/min，时间间隔为8s。

2 结果与讨论

2.1 不同发酵温度下多糖含量变化

酸乳胞外多糖经分离纯化后得到的多糖含量曲线如图1。

图1 不同温度下多糖含量曲线Fig.1 Content of exopolysaccharides at different fermented temperature

由图1可知，在酸乳发酵温度不同的条件下，37℃发酵酸乳多糖含量最高，达到461.4mg/L；40℃发酵酸乳多糖含量次之，为345mg/L；43℃发酵酸乳多糖含量最低，为247.6mg/L。Saija N[16]等指出胞外多糖产量与产糖菌株生长环境pH、温度及蛋白含量组分有关。由于SephacrylS-300凝胶柱层析是根据分子筛效应对多糖进行等级分离纯化的，所以，从图1可以看出，不同温度下的多糖，不仅含量不一样（峰的高度），而且分子量分布也有很大不同（洗脱体积的差异），本实验中大分子的多糖含量较高，小分子的多糖含量相对较低。而对多糖而言，分子量越大，其产生的粘度就越大。由此可以推测，在本实验测定范围内，低温（37℃）发酵酸乳产的多糖分子量大，且其粘度高；而高温（43℃）的多糖分子量相对较小，其粘度也相对较低。魏淑珍[17]等对一株嗜热链球菌产胞外多糖的工艺进行了优化，经过不同培养温度的MRS培养基发酵培养后得出，39℃为其最适发酵温度，多糖产量为844mg/mL。不同菌种发酵培养产胞外多糖的含量也不尽相同[18]，造成这一现象的原因可能主要是因为培养温度的不同以及菌株产胞外多糖种类之间存在的差异，从而使其胞外多糖合成含量不同。

2.2 添加不同来源EPS酸乳的黏度和剪切应力

添加不同来源EPS酸乳的黏度和剪切应力随时间变化的测定结果如图2、图3。

利用流变仪分别测定含内源性EPS、外源性EPS酸乳的黏度，结果表明：酸乳黏度随转速的变化趋势相同（图2），酸乳黏度随转速的上升，先急速上升，有一个极大值，然后又下降，最终趋于平缓；在降速测定时，相同转速条件下，测得结果要比升速测定的结果小，说明有剪切稀释现象。但从实验结果可以很明显地看出，含内源性EPS酸乳的黏度要远高于外加内源性EPS酸乳的粘度。在胞外多糖与酪蛋白存在相斥作用的情况下，随着乳酸菌胞外多糖含量的增加，多糖所形成的网孔会越来越小，此时形成的酪蛋白胶凝颗粒也会变得越来越小，因而会使其表观黏度降低[10]。

由图3可以看出，添加不同来源EPS酸乳的剪切应力都形成了触变环，说明它们都是触变体系。触变环的面积反映了触变性的大小。同时，从图3可以明显看出内源性EPS发酵酸乳的触变环面积较外源性EPS酸乳的大，说明含有内源性EPS的酸乳经外力作用后，其应力变化较外源性EPS酸乳的大，外力撤出后，此体系回复到未经外力作用的体系状态所需的时间也更长。这与赵正涛[10]、Janaina[19]等的报道结果趋势类似，但较本实验中剪切应力值小，这可能主要是因为增稠剂的种类不同及其添加量影响酸乳的黏度及剪切应力。

图2 添加不同来源EPS酸乳的黏度Fig.2 Viscosity of yogurt with different addition of exopolysaccharides

图3 不同来源EPS的酸乳样品在变速剪切下的剪切应力的变化Fig.3 Variable speed controlled shearing against shearing stress of yogurt with exopolysaccharides from different sources

2.3 EPS不同添加方式下酸乳表观黏度随时间变化

图4 不同添加方式下酸乳样品表观黏度随时间变化Fig.4 The apparent viscosity of yogurt with exopolysaccharides from different sources changes with time

添加不同来源EPS酸乳的表观粘度随时间变化如图4。

由图4可以看出，在相同发酵温度、相同菌种接种量、相同终点发酵酸度的酸乳样品，添加不同来源EPS，经在恒温、恒速的剪切作用下，其表观黏度都逐渐减小，并且较好地遵循对数曲线方程。内源性EPS对其线性回归得方程为y内=-69.7ln（x）+350.8，其相关系数为0.9527；外源性EPS对其线性回归得方程为y外=-128.9ln（x）+633.75，其相关系数为0.9015。其中，内源性EPS酸乳的表观黏度要明显高于外源性EPS酸乳的表观黏度，但随着剪切时间的推移，二者基本持平。这可能主要是因为在内源的乳酸菌EPS渐进产生和逐步形成“网络”的干扰下，酪蛋白絮凝形成的立体网状结构才能连续而且细密。

我们认为外源的EPS会导致形成的酸乳凝胶连续性较差，酪蛋白在具有强大的空间位垒和排斥作用的EPS网络提前形成的条件下，其絮凝在构建立体网状结构时，只能形成细碎、不连续的结构，严重干扰了酸乳立体网状结构的形成[20]，从而使其黏度下降。Girard M[3]等在研究五种胞外多糖与牛奶蛋白的相互作用时，指出在pH5.4和6.1时，胞外多糖含量的增加，酪蛋白受到的影响较小，而对乳清蛋白影响较大，乳清蛋白跟乳酸菌胞外多糖黏附于一起。因而可以推断，随着酸乳凝胶的形成，pH的降低，酪蛋白逐渐达到其等电点，发生变性，使其黏度逐渐变小，而pH的变化对乳清蛋白的影响较小。

2.4 EPS不同添加方式酸乳的STS和WHC

不同来源EPS制作的酸乳的STS值与WHC值如图5。

图5 EPS不同添加方式酸乳的STS和WHCFig.5 STS and WHC of yogurt addition with different exopolysaccharides

酸乳STS是酸乳凝胶对各种乳成分，尤其是水分的结合能力，这种结合力包括结合水凝胶立体网络中自由的结合能力；酸乳WHC是指一定量的酸乳在一定的温度、离心力、时间的作用下，酸乳凝胶对水分的结合能力。

图5显示，内源性EPS酸乳的WHC较外源性EPS酸乳的高出26%，STS较外源性EPS酸乳低46%。这说明内源性EPS的酸乳在规定的时间内失去的乳清最少，体系的大分子结合水的含量最高，稳定性最好，而外源性EPS酸乳的STS值大，WHC值相对较小，说明其乳清析出最多，稳定性也差。即直接添加粘性保加利亚菌株发酵复原脱脂乳制成的EPS，酸乳的稳定性更好。

综上所述，在温度对酸乳中乳酸菌胞外多糖影响作用的机制研究方面，本研究发现：不同发酵温度酸乳产胞外多糖含量不同，低温更利于乳酸菌胞外多糖的形成。由于多糖分子通过静电作用和自身形成的空间位垒作用影响酸乳网状结构的形成，从而降低酪蛋白立体网状结构的牢固程度。当高温发酵酸乳时，其乳酸菌胞外多糖含量较低时，形成的网眼较大，酪蛋白凝集体过大，导致酸乳乳清析出严重。随着酸乳发酵温度的降低，其乳酸菌胞外多糖含量增加，多糖分子不仅本身吸收自由水分子的数量增加，而且本身产生的空间位垒效应不断增强，导致酪蛋白凝集体变得细小，进一步减少了乳清析出，从而表现为酸乳的表观黏度和剪切应力下降。酸乳产生的内源性胞外多糖随发酵时间的延长而增多，其体系中的分子相互作用是逐步缓慢进行的。但外源性胞外多糖酸乳体系的多糖含量一定，在发酵过程中多糖含量慢慢降低。由于一开始多糖含量较高，使其与原料乳中蛋白等充分作用。但随着发酵时间的延长，酸乳体系中多糖含量减少，使多糖分子与蛋白之间的相互作用减弱。这表现在产品特性上，内源性EPS酸乳的乳清析出较少，稳定性高。

3 结论

3.1 酸乳乳酸菌胞外多糖产量随温度的变化而不同，37℃发酵酸乳多糖含量远高于40、43℃发酵酸乳，达到最高值，多糖含量为461.4mg/mL，43℃发酵酸乳多糖含量最低，为247.6mg/mL。说明在本实验温度测定范围内，低温有利于乳酸菌胞外多糖的形成。

3.2 酸乳产生的内源性胞外多糖表现在产品特性上，其表观黏度及剪切应力随时间的变化都明显高于添加外源性胞外多糖的酸乳，且都较好地遵循对数曲线方程，表明内源性EPS制成的酸乳其粘弹性更好。

3.3 内源性EPS酸乳的WHC要高于外源性EPS酸乳的，即表明直接添加粘性保加利亚菌株发酵复原脱脂乳制成的EPS，酸乳的乳清析出较少，稳定性更好。

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Effect mechanism of fermentation temperature on the characteristics of bacteria exopolysaccharides in yogurt

YANG Tong-xiang，WANG Fang，LI Quan-yang*
（College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

The changes of extracellular polysaccharides content at the different fermentation temperature of yoghurt and the effects of different sources of extracellular polysaccharides on the rheology properties of yogurt were studied.The result showed：the content of exopolysaccharides was highest（247.6mg/mL）in yogurt fermented at 37℃，whereas，it was the lowest，only 247.6mg/mL，at 43℃.The apparent viscosity and shear stress of samples changing against time were obviously（P＜0.05）higher than that of adding exogenous exopolysaccharide.The regression curves of apparent viscosity against shear time were found to conform to a logarithmic function，y=kLn（x）+b.In addition，water holding capacity（WHC）of yogurt with endogenous exopolysaccharide was 26%higher than that of adding exogenous exopolysaccharide.Susceptibility to syneresis（STS）of yogurt with endogenous exopolysaccharide was 46%lower than adding exogenous exopolysaccharide. It showed temperature was favorable for lactic acid bacteria exopolysaccharides formation，and the yoghurt with endogenous extracellular polysaccharide showed a higher viscosity and water holding capacity.

yogurt；fermentation temperature；exopolysaccharide；rheological characteristics

TS252.1

A

1002-0306（2012）09-0058-04

2011－08－02 *通讯联系人

杨同香（1983-），女，博士研究生，研究方向：生物大分子与功能性食品。

国家自然科学基金项目（31071576）；广西大学人才资助项目（XZL090325）。