越橘粗提物体外抑菌活性及稳定性的研究

陈 沙，罗秋水，张凤英

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

越橘粗提物体外抑菌活性及稳定性的研究

陈 沙，罗秋水，张凤英*

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

研究了两种越橘（野生蓝莓和红豆越橘）粗提物的抑菌作用及稳定性。方法：采用牛津杯法探讨越橘果粗提物对6种食源性致病菌和1种食品中常见腐败菌的抑菌作用及温度、pH、紫外线等因素对抑菌稳定性的影响。结果：越橘对金黄色葡萄球菌等7种细菌具有明显的抑菌作用，最大抑菌直径可达30mm。经测定，野生蓝莓对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌7种菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为：9.38、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL；红豆越橘的最低抑菌浓度（MIC）分别为：18.75、18.75、37.50、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL。野生蓝莓较红豆越橘提取物抑菌活性稳定，受紫外线照射、温度、无机盐等因素影响较小。结论：越橘提取物具有较强的广谱抑菌效果，且受外界影响小，抑菌稳定性好。在食品中添加越橘提取物，既能提高食品的功能品质，又能提高食品的卫生安全。

野生蓝莓，红豆越橘，抑菌谱，稳定性

越橘（Billberry）归于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属[1]，为多年生落叶常绿灌木或小灌木树种。在我国，越橘品种表现为区域化生产，各品种群各有其特点，可以适应各地的气候条件。野生蓝莓（blueberry）和红豆越橘（Vaccinium vitis-idaea L）同为越橘属的两个品种，产自大兴安岭地区[2-4]。越橘不仅对人体防癌、防血管收缩、消除体内自由基、延缓人体衰老等有重要作用，而且具有保护眼睛、抗氧化、提高记忆力、预防动脉粥样硬化、抗尿路感染、抗癌、抗辐射等诸多功能[5]。越橘具有较强的药理作用及保健功能，其营养成分不限于果糖、蛋白质、脂肪、果胶、维生素等成分，更重要的是富含熊果苷、花色苷、类黄酮、多酚类物质和细菌生长抑制剂等。根据美国Tufts大学的分析，在40种具有抗氧化能力的蔬菜和水果中，越橘原花青素的含量及抗氧化能力排名第一[6]。近年来，人们对多酚物质抑制人类病原微生物给予高度的关注。研究发现葡萄、苹果、啤酒花和中国绿茶中的多酚物质可以抑制牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生长[7]；葡萄酒和植物多酚可抑制幽门螺杆菌毒素并治疗由其导致的疾病[8]；五倍子（Galla Chinensis）多酚提取物对变异链球菌（Streptococcus mutans）有抑制作用[9-10]。由此可见，多酚类物质除了对人体或动物组织细胞代谢的直接作用外，还对致病微生物产生控制作用，从而发挥其调节人体消化道微生物菌落的作用[11]。因此本实验以越橘为材料，研究了在不同的提取条件下越橘粗提液对6种食源性致病菌和1种食品中常见腐败菌的抑菌作用及温度、pH、紫外线等因素对抑菌稳定性的影响，并测定其对各供试菌株的最低抑菌浓度。为越橘的进一步研究与开发提供科学的依据，也可为今后将越橘开发成一种天然的免疫抑菌剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella typhi）、志贺氏菌（Shigella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus Sukatilis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus） 均为本院微生物教研室保藏菌种；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（PBA）[12]牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；野生蓝莓、红豆越橘 由大兴安岭塔河县绿野山产品开发有限公司提供。

自动式电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40B） 上海申安医疗器械厂；电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-IFD超净工作台 苏净集团安泰公司；UNICO-2100紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；牛津杯 外直径8mm，内直径6mm，高度10mm的不锈钢制品。

1.2 实验方法

1.2.1 供试菌株的活化 将所有供试菌转接入PBA试管斜面培养基上，每个菌接种多管，置于35～37℃恒温培养箱内培养24h，每种菌取2支供测试用，其余注明日期，置于4℃冰箱中冷藏备用。

1.2.2 PBA平板培养基的制备 将配制好的PBA培养基高压蒸汽灭菌（121℃、20min），冷却至50～60℃，采用无菌操作倾注于灭菌培养皿内，每培养皿装15～20mL（皿内培养基的厚度约3～5mm）即可，然后低温保存备用。

1.2.3 供试菌株悬浮液的制备 分别用接种针挑取少许活化后菌体接种于装有玻璃珠及50mL无菌生理盐水的三角瓶中，振荡10min，制成均匀的菌悬液。用比浊法计数，调整菌悬浮液的浓度，使菌体量在106～107个/mL之间，备用。

1.2.4 两种越橘粗提液的制备 精密称取5g野生蓝莓或红豆越橘置于50mL无菌去离子水中，不同温度下浸提2h，得水提液50mL，以22000r/min离心20min去沉淀，得100mg/mL野生蓝莓或红豆越橘水提液，冷藏备用，上述操作在无菌条件下进行。使用时用无菌水稀释成所需浓度（100、90、80、70、60、50、40、30mg/mL）即可。

1.2.5 抑菌实验方法 采用牛津杯法[13-14]。先分别用移液枪向PBA平板上加0.2mL各种菌悬液，并用无菌涂布器涂布均匀。用无菌镊子夹取烘干的无菌牛津杯，轻轻平置于已涂布菌液的平板培养基表面，每个培养皿放置3只牛津杯，然后向每个牛津杯加入200μL不同质量浓度的越橘粗提液，并以0.85%的无菌生理盐水作对照。将培养皿置于恒温培养箱35～37℃恒温培养24h后，取出测定抑菌圈直径，取平均值。抑菌圈直径越大，抑菌效果越好。每个供试菌种、每个提取浓度做3个重复。

1.2.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定[15]采用二倍稀释法将越橘提取物原液用去离子水稀释成300、150、75、37.50、18.75、9.38mg/mL的系列浓度。采用混平板稀释法[16]，分别吸取1mL不同浓度的提取物稀释液于9mL已灭菌的PBA培养基中，混匀倒平板冷凝。用移液枪吸取100μL相应菌悬液于平板中并涂布均匀，置于生化箱中培养，使其成为含一系列浓度梯度越橘提取物的微生物培养基平板。以加入无菌生理盐水的培养基为对照，每个浓度做3个平行样，菌落被完全抑制的浓度为最低抑菌浓度。

1.2.7 越橘提取液的稳定性研究 取一定量1.2.4的样品，用无菌去离子水稀释后，进行如下处理：分别置于不同的温度（20、40、60、80、100℃）条件下；将样品调制成不同的pH（2、4、6、8、10）；取20mL样品液置于培养皿中，打开皿盖，在无菌室紫外灯下照射不同的时间（2、4、6、8、10h）；将氯化钠配制成不同浓度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）后加入到样品中。根据1.2.5的方法研究越橘粗取液的抑菌作用，以抑菌圈直径为评价指标，测定越橘水提液在不同条件下的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 两种越橘水提液抑菌谱的研究

2.1.1 抑菌谱研究 从表1和表2可以看出，两种越橘提取液对6种常见的食源性致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、志贺氏菌细菌的抑制作用均比较显著，对食品污染中常见细菌枯草芽孢杆菌的抑菌作用也较强。越橘提取液浓度与抑菌活性之间具有明显的量效关系，即随着越橘提取液浓度的升高，抑菌作用加强。浓度在60～100mg/mL范围内抑菌作用较强，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，野生蓝莓对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径可达30.0mm、大肠杆菌达22.0mm、产气杆菌12mm、沙门氏菌20.0mm、溶血性链球菌22.5mm、志贺氏菌达21.5mm、枯草杆菌23.0mm；红豆越橘对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为26.6mm，大肠杆菌达23.5mm、产气杆菌12.8mm、溶血性链球菌19.6mm、沙门氏菌16.2mm、枯草芽孢杆菌14.6mm、志贺氏菌16.8mm。

2.1.2 最低抑菌浓度（MIC）的研究 从表3和表4中可看出，即使是在较低的浓度条件下，野生蓝莓水提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用都比较强，野生蓝莓提取液对大肠杆菌的MIC低至18.75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC更是低达9.38mg/mL，对枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、溶血性链球菌、志贺氏菌和产气肠杆菌的MIC值分别为：18.75、18.75、37.50、37.50、18.75mg/mL；红豆越橘提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC为18.75mg/mL，对沙门氏菌、溶血性链球菌、志贺氏菌和产气肠杆菌的MIC值分别为：18.75、37.50、37.50、18.75mg/mL。

表1 野生蓝莓水提液抑菌谱Table 1 Antibacterial spectrum of water extract of wild blueberry

表2 红豆越橘水提液抑菌谱Table 2 Antibacterial spectrum of water extract of Vaccinium vitis-idaea L

表3 野生蓝莓水提液的最低抑菌浓度Table 3 MIC of water extract of wild blueberry

表4 红豆越橘水提液的最低抑菌浓度Table 4 MIC of water extract of Vaccinium vitis-idaea L

2.2 越橘提取液抑菌稳定性研究

图1 野生蓝莓在不同温度下的抑菌作用Fig.1 Antimicrobial activity of wild blueberry at different temperatures

2.2.1 温度对越橘水提液抑菌效果的研究 以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，测定不同温度下野生蓝莓和红豆越橘提取物的抑菌活性。由图1可知，随着处理温度的升高，野生蓝莓抑制大肠杆菌活性有所升高，但是变化不大，120℃处理后仍然具有较好的抑菌作用；对金黄色葡萄球菌的抑菌活性表现为不稳定性，时高时低；对枯草芽孢杆菌的稳定性较好，随着温度的升高抑菌活性变化不大。由图2可以看出，红豆越橘提取液随温度的升高，抑菌稳定性较差，对三种指示菌的抑菌作用均不太稳定，总体上随着温度升高对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用有所增强，且抑菌圈直径均大于6mm。

图2 红豆越橘在不同温度下的抑菌作用Fig.2 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different temperatures

2.2.2 紫外线对越橘提取液抑菌效果的研究 以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，研究紫外照射对越橘提取物抑菌活性的影响。由图3可以看出，野生蓝莓提取液经紫外线照射10h后对三种菌均有较好的抑制作用。照射时间为4h时，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径仍能达到30mm，同时随照射时间的延长，抑菌效果相对较稳定。由图4可以看出，红豆越橘提取液在紫外线照射下对大肠杆菌的抑制作用较稳定，随紫外线照射时间的延长，抑菌作用基本保持不变；而对另外两种菌则不稳定，随时间的延长抑菌作用明显减弱，照射4h后提取液对枯草芽孢杆基本没有抑制作用。总之，经紫外线照射处理后的野生蓝莓提取物的抑菌稳定性比红豆越橘好。

图3 紫外照射时间对野生蓝莓抑菌作用的影响Fig.3 Antimicrobial activity of wild blueberry at different UV irradiation time

图4 紫外照射时间对红豆越橘抑菌作用的影响Fig.4 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different UV irradiation time

2.2.3 pH对越橘水提液抑菌效果的研究 以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，测定不同pH对两种越橘提取物抑菌活性的影响。由图5可知，野生蓝莓在pH大于6时对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均没有抑菌作用，但对大肠杆菌却依然有较稳定的抑菌活性。由图6可知，当pH由强酸性变为中性时，红豆越橘对枯草芽孢杆菌的抑制作用较稳定，基本保持不变；pH小于8时对金黄色葡萄球菌抑菌作用较强，pH大于8就逐渐失去抑菌活性；对大肠杆菌，随着pH的增大红豆越橘的抑菌活性还有所提高。综合来看，两种越橘提取物的抑菌活性均在酸性条件下更稳定。

图5 野生蓝莓在不同pH条件下的抑菌作用Fig.5 Antimicrobial activity of wild blueberry at different pH

图6 红豆越橘在不同pH条件下的抑菌作用Fig.6 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different pH

2.2.4 氯化钠对越橘水提液抑菌效果的研究 以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，研究氯化钠对越橘提取物抑菌活性的影响。由图7可知，氯化钠浓度的变化对野生蓝莓抑菌活性影响很小，且抑菌圈直径都在14mm以上，抑菌稳定性好。由图8可以看出，随着氯化钠浓度的增大，红豆越橘对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用减弱，抑菌稳定性较差；对金黄色葡萄球菌则影响不大，具有较好的抑菌稳定性。综上所述，有氯化钠存在时野生蓝莓的抑菌稳定性比红豆越橘好。

图7 野生蓝莓在不同无机盐浓度条件下的抑菌作用Fig.7 Antimicrobial activity of wild blueberry at different content of inorganic salts

图8 红豆越橘在不同无机盐浓度条件下的抑菌作用Fig.8 Antimicrobial activity of Vaccinium vitis-idaea L at different content of inorganic salts

3 结论

越橘粗提液对6种食源性致病菌和食品中常见腐败菌（枯草芽孢杆菌）都有较强的抑制活性。两种越橘粗提液浓度在60～100mg/mL范围内抑菌作用较强，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，野生蓝莓对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径可达30.0mm、大肠杆菌达22.0mm、产气杆菌12mm、沙门氏菌20.0mm、溶血性链球菌22.5mm、志贺氏菌达21.5mm、枯草芽孢杆菌23mm；红豆越橘对金黄色葡萄球菌为26.6mm，大肠杆菌达23.5mm、产气杆菌12.8mm、溶血性链球菌19.6mm、沙门氏菌16.2mm、枯草芽孢杆菌14.6mm、志贺氏菌16.8mm。同时经测定，野生蓝莓对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌7种菌的最低抑菌浓度分别为：9.38、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL；红豆越橘的最低抑菌浓度分别为：18.75、18.75、18.75、37.50、37.50、18.75、18.75mg/mL。

另外，经紫外线照射处理后的野生蓝莓提取物的抑菌稳定性比红豆越橘更好，有氯化钠存在时野生蓝莓的抑菌稳定性也比红豆越橘好，两种越橘提取物的抑菌活性均在酸性条件下更稳定，在20～120℃范围内均具有较好的抑菌活性。总体上看，野生蓝莓提取物抑菌活性较稳定，受环境因素影响较小。如将纯化的越橘提取液应用于食品的防腐保鲜，其能够适应不同食品的加工环境，从而起到延长食品保质期的目的。

越橘提取物具有较强的广谱抑菌效果，且受外界影响小，抑菌稳定性好。在食品中添加越橘提取物，既能提高食品的功能品质，又能提高食品的卫生安全。越橘提取物有成为一种广谱、安全、高效的天然抑菌剂的潜力。

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Study on antimicrobial properties and stability of extracts from berries

CHEN Sha，LUO Qiu-shui，ZHANG Feng-ying*
（School of Food Science and Technology，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045，China）

Antimicrobial properties and stability of extracting solution from two billberries（wild blueberry and Vaccinium vitis-idaea L）were studied.The antimicrobial properties of extracting solution from two berries against six food-borne pathogens and one spoilage bacteria from food were screened by oxford cup and doubling dilution method measured minimum inhibitory concentration（MIC），the antimicrobial stability under certain temperature，pH，UV exposure time and so on.The result showed that bacterias like Staphylococcus aureus and other six bacterial were inhibited by the extracting solution well.The biggest antibacterial circle diameter reached 30.0mm.the MIC of blueberry extracts against Staphylococcus aureus was 9.38mg/mL，Escherichia coli 18.75mg/mL，Enterobacter aerogenes 18.75mg/mL，Salmonella typhi 37.50mg/mL，Streptococcus hemolytic 37.50mg/mL，Shigella 18.75mg/mL，Bacillus Sukatilis 18.75mg/mL.The MIC of Vaccinium vitis-idaeaL extracts against Staphylococcus aureus was 18.75mg/mL，Escherichia coli 18.75mg/mL，Enterobacter aerogenes 37.50mg/mL，Salmonella typhi 37.50mg/mL，Streptococcus hemolytic 37.50mg/mL，Shigella 18.75mg/mL，Bacillus Sukatilis 18.75mg/mL.Extracts under acid conditions had good antibacterial effect，antibacterial activity of wild blueberry extracts was more stable.By UV exposure time，temperature，inorganic salts and other environmental factors less effected.Conclusions：billberry had strong broad-spectrum antimicrobial effects，and little outside influence，antibacterial stability，added billberry extracts in food，not only the function of quality was improved but also the food safety.

wild blueberry；Vaccinium vitis-idaea L；antibacterial spectrum；stability

TS255.1

A

1002-0306（2012）09-0158-05

2011－09－07 *通讯联系人

陈沙（1986-），女，在读硕士，研究方向：食品微生物与发酵工程。