凡纳滨对虾肌肉蛋白质组成及分子量分布研究

蓝尉冰，毛伟杰，池岸英，吉宏武，*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025；2.广东省高等学校水产品加工重点实验室，广东湛江524025）

凡纳滨对虾肌肉蛋白质组成及分子量分布研究

蓝尉冰1，2，毛伟杰1，池岸英1，2，吉宏武1，2，*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524025；2.广东省高等学校水产品加工重点实验室，广东湛江524025）

为了合理利用凡纳滨对虾蛋白质，对凡纳滨对虾肌肉进行蛋白分离，利用氨基酸自动分析仪检测蛋白的氨基酸组成及用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定分子量分布。实验结果表明：总蛋白为（19.72±0.08）g/100g湿重，其中盐溶蛋白64.30%、水溶性蛋白25.00%、基质蛋白5.78%、非蛋白氮4.92%；凡纳滨对虾各蛋白氨基酸比例存在一定差异，但它们的第一限制氨基酸类似；SDS-PAGE电泳显示，凡纳滨对虾基质蛋白分子量分布范围较宽，集中在200～19ku，盐溶蛋白分子量集中在200～45ku，水溶性蛋白分子量集中在80～27ku。

凡纳滨对虾，蛋白质分离，氨基酸，分子量分布

凡纳滨对虾又称南美白对虾（Penaeus vannamei Boone）[1]，属对虾科（Family Penaeidae）、对虾属（Genus Penaeus）、白对虾亚属（Subgenus Litopenaeus），原产于南美太平洋沿岸的水域，以厄瓜多尔沿岸分布最为集中，是当今世界养殖虾类产量最高的三大品种之一[1]。该虾肉质鲜美，蛋白含量高，加工出肉率高，是目前我国养殖量最大的对虾之一[2]。凡纳滨对虾捕获量大，但在气温高时，鲜虾不宜保存，易腐败，除少数鲜售外，大多制成经济价值不高的虾皮、虾酱等，有相当一部分因未能得到及时有效的利用而腐败变质，造成很大的资源浪费。因此，了解凡纳滨对虾蛋白质的构成及其食品化学特性，对于如何合理利用凡纳滨对虾这一蛋白质资源具有重要的现实意义。近年来，有关南美白对虾肌肉营养成分的研究工作已有不少[3]。潘英[4]等人进行海水和淡水养殖南美白对虾肌肉营养成分的分析比较研究；韩素珍[5]对中国对虾、姚根娣[6]对罗氏沼虾进行肌肉总蛋白分析。但迄今为止，尚未见到对于虾肌肉蛋白进行系统分离的报道，这使得凡纳滨对虾合理加工及其高值化应用受到一定限制。本文在Saito[7]的基础上，对凡纳滨对虾蛋白进行分离，并测定各蛋白组分含量、氨基酸组成并对其进行蛋白质营养价值评价、分子量分布等，旨在为凡纳滨对虾蛋白质资源利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜凡纳滨对虾（Penaeus Vannamei） 于2010年11月20号购于湛江市东风市场；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白标准品 TaKaRa宝生物工程有限公司；KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、H3PO4、考马斯亮蓝R250等 均为分析纯。

HR2864飞利浦三合一搅拌器 珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司；FA2004电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 湛江裕鑫实业有限公司；PB-10玻璃膜电极pH测量器 德国赛多利斯集团；HYP-2消化炉 上海纤检仪器有限公司；日立835-50高速氨基酸分析仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；DYY-Ⅲ-4型稳压稳流电泳仪、DYCZ-23A型电泳槽 北京六一仪器厂；UC-1200超声波清洗机 广州维力超声电子设备有限公司；arium633/arium611超纯水系统 德国Sartorious公司；HH.S21-6恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂；Alpha1-4冷冻干燥机 德国Christ公司；3-550 PD.NEY马弗炉 VULCAN；FR-1000生物图像分析系统 上海复日科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本营养成分分析 水分含量的测定：105℃干燥至恒重法[8]；粗蛋白质含量的测定：凯氏定氮法[9]；粗脂肪含量的测定：索氏抽提法[10]；灰分含量的测定：550℃灰化炉法[10]。

1.2.2 肌肉蛋白质分离方法 参照Saito[7]等的方法稍作修改。取虾肉分散于2倍体积的磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）中，高速组织匀浆机匀浆2min，匀浆液置于4℃条件下，抽提90min（不时搅拌），离心（10000r/min，20min，4℃），收集上清液，将沉淀分散于磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）中，重复上述操作，收集两次离心后的上清液进行水溶性蛋白的测定。在上清液中加入10%的TCA（比例1∶1），离心得上清液，用于非氮白氮（NPN）的测定。取上述除去水溶性蛋白后的残留物，分散于4倍体积的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.4含1.1mol/L的NaCl）中，高速组织匀浆机匀浆2min，置于4℃条件下抽提18h（不时搅拌），再对其离心（10000r/min，20min，4℃），所得上清液即为盐溶性蛋白质；所得的沉淀用蒸馏水、1.1mol/L NaCl洗涤3次，即得基质蛋白。

1.2.3 蛋白质和非蛋白氮测定[9]采用微量凯氏定氮法测定蛋白质和非蛋白氮含量。

1.2.4 蛋白质组分的氨基酸分析[11]样品经6mol/L HCl水解后，采用日立835-50型高速氨基酸分析仪进行15种蛋白质组成氨基酸的分析。另取样品用5mol/L NaOH水解后，采用同机测定色氨酸含量。仪器参数如下：离子交换柱规格：2.6×150mm；交换树脂型号：No 2619（52051）；柱温：53℃；泵流速：0.225mL/min；泵压力：8.8MPa；洗脱液：IPH-1、2、3、4；进样体积：50μL。氨基酸的含量（mg/g粗蛋白）表示为蛋白中每克粗蛋白所含氨基酸的毫克数。

1.2.5 蛋白质的营养价值评价 根据1973年FAO/ WHO建议的每克氮氨基酸评分标准模式进行营养价值评价[12]，计算其氨基酸评分（AAS），公式如下。

1.2.6 蛋白质组分分子量的测定[13]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质组分分子量的测定，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度10%，采用R-250考马斯亮蓝进行染色检测，醋酸甲醇溶液进行脱色。

1.3 数据统计分析

实验数据和作图均采用Excel。

2 结果与讨论

2.1 凡纳滨对虾基本营养组成

凡纳滨对虾基本营养组成及与其他虾类的基本营养组成比较见表1。

由表1可见，凡纳滨对虾肌肉中水分为77.7%，与日本对虾[16]相近。蛋白质含量19.72%，略低于中国对虾20.62%[14]，但高于中国毛虾和日本对虾。脂肪含量均低于中国对虾、中国毛虾、日本对虾。因此，凡纳滨对虾肉是一种高蛋白低脂肪的优质水产原料。

2.2 凡纳滨对虾含氮化合物组成

表1 凡纳滨对虾与其他虾类基本营养组成比较（%，n=5）Table 1 Comparison of the primary nutrition components in Penaeus Vannamei and other shrimp（%，n=5）

表2 凡纳滨对虾各含氮化合物含量（n=5）Table 2 Content of nitrogen compounds in Penaeus Vannamei（n=5）

凡纳滨对虾含氮化合物组成分析结果见表2。

对凡纳滨对虾肌肉进行粗分离，得到水溶性蛋白、盐溶性蛋白、基质蛋白和非蛋白氮四个组分，各组分含量见表2。由表2可见，凡纳滨对虾肌肉粗蛋白含氮量为（19.72±0.08）g/100g湿重，与潘英[4]等人进行海水和淡水养殖南美白对虾肌肉营养成分的分析比较研究，得出南美白对虾肌肉的蛋白质含量为19.1%～23.3%相符合。其中盐溶性蛋白含氮量最高，为（12.68±0.04）g/100g湿重；非蛋白氮含氮量最低，为（0.97±0.02）g/100g湿重。各蛋白组分含氮量依次为：盐溶性蛋白＞水溶性蛋白＞基质蛋白。

2.3 凡纳滨对虾肌肉各含氮化合物占总氮的百分比

凡纳滨对虾肌肉各含氮化合物占总氮百分比分析结果见表3。

表3 凡纳滨对虾肌肉中各含氮化合物所占总氮的百分比（%）Table 3 The percentage of nitrogen compounds in Penaeus Vannamei muscle（%）

对凡纳滨对虾肌肉进行粗分离，得到水溶性蛋白、盐溶性蛋白、基质蛋白三个蛋白组分，各蛋白组分含氮量占凡纳滨对虾虾肉总氮的比例见表3。由表3可知，凡纳滨对虾肉中盐溶性蛋白所占比例最高，为64.30%，基质蛋白所占比例最低，为5.78%。此结果与丁玉庭[17]等人研究分离得到的鱼蛋白组分含量：肌原纤维蛋白质占总氮的60.7%～64.4%，肌浆蛋白质为26.1%～33.2%，总基质蛋白质为9.0%～20.8%相符合，发现凡纳滨对虾的盐溶性蛋白含量与鱼盐溶性蛋白含量相近，而基质蛋白含量远低于鱼基质蛋白含量，这主要是由于鱼含有鱼皮及结缔组织高于虾的缘故。

2.4 凡纳滨对虾虾肉蛋白组分的氨基酸组成及特性分析

凡纳滨对虾肌肉蛋白及各组分蛋白氨基酸组成见表4，由表4可知，凡纳滨对虾虾肉中含有16种氨基酸，其总含量为86.28g/100g，且含有人体所必需的8种必需氨基酸（Thr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Trp和Lys），占总氨基酸高达41.31%；各蛋白氨基酸总量依次为：虾肉＞水溶性蛋白＞盐溶性蛋白＞基质蛋白，分别为：86.28、68.06、50.73、24.25g/100g。蛋白盐溶蛋白和基质蛋白必需氨基酸分别为40.82%和41.81%，根据FAO/WHO推荐的理想氨基酸模式，质量较好的蛋白质氨基酸组成中必需氨基酸为氨基酸总量40%左右。因此盐溶蛋白、基质蛋白和虾肉蛋白的氨基酸成分齐全，比例合理，蛋白营养价值高，属于优质蛋白。

虾肉味道鲜美的程度由肌肉中鲜味氨基酸的组成和含量来决定。甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸是鲜味氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸这两种氨基酸为呈鲜味的特征性氨基酸，而甘氨酸、丙氨酸是呈甘味的特征性氨基酸[18]。由表4可知，凡纳滨虾肉及各组分蛋白氨基酸含量中，基质蛋白呈味氨基酸最高，达到52.95%，盐溶性蛋白呈味氨基酸较低，为47.80%。而在呈味氨基酸中，谷氨酸居首位，分别为：虾肉（13.48）、水溶性蛋白（8.58）、盐溶性蛋白（8.73）、基质蛋白（3.66），分别占总氨基酸含量15.62%、12.61%、17.21%、15.09%。这与潘英[4]等人报道的南美白对虾肌肉谷氨酸含量最高，占氨基酸总量的15.6%一致。谷氨酸在人体代谢中具有重要意义，为脑组织生化代谢中的首要氨基酸，参与多种生理活性物质的合成，在大脑肌肉肝脏等组织中发挥解毒的作用。肌肉中除谷氨酸外，天门冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸的含量也较高。故凡纳滨对虾水溶性蛋白、盐溶蛋白、基质蛋白和虾肉蛋白是一种营养价值高、味道鲜美、食用价值高的海产品。

表4 凡纳滨对虾虾肉蛋白组分的氨基酸组成（g/100g，以干基计）Table 4 Amino acids composition of proteins in Penaeus Vannamei muscle（g/100g，dry basis）

此外，支链氨基酸具有独特的生理功能，能消除或减轻肝性脑病症状，改善肝功能和病人蛋白质营养失常状态及抗疲劳等功能[19]。在凡纳滨对虾肌肉各蛋白组分中支链氨基酸的含量都较高，基质蛋白支链氨基酸含量最高，达16.99%，而水溶性蛋白支链氨基酸含量较低，为15.25%。

2.5 凡纳滨对虾虾肉蛋白组分必需氨基酸评分

表5 凡纳滨对虾虾肉蛋白组分必需氨基酸评分Table 5 AAS of proteins in Penaeus Vannamei muscle

凡纳滨对虾肌肉及其分离蛋白的AAS见表5，根据FAO/WHO 1973年建议的每克氮氨基酸评分标准模式，由表5可见，各蛋白的氨基酸比例存在一定的差异，水溶性蛋白、盐溶蛋白第一限制氨基酸都为色氨酸，仅为48、35。但水溶性蛋白酪氨酸+苯丙氨酸的AAS较高，达到了91。基质蛋白第一限制氨基酸为缬氨酸和色氨酸，仅为21。虾肉蛋白第一限制氨基酸为苏氨酸，为79，而其赖氨酸含量最高，为127。赖氨酸可以促进食欲，具有促进幼儿生长和发育的作用，还能提高钙的吸收及其在体内积累，加速骨骼生长，所以虾肉高赖氨酸含量对于以谷物为主的膳食者，可以弥补其赖氨酸的不足，从而提高人体对蛋白质的利用率。

2.6 凡纳滨对虾各蛋白质组分分子量分布

图1 蛋白质组分SDS-PAGE电泳Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of the muscle proteins

从图1结果可看出，三种蛋白质组分的分子量分布存在明显的差异性，基质蛋白分子量分布范围较宽，在200～19ku之间，并且在200、44、27ku均出现了比较明显的蛋白条带。凡纳滨对虾肌肉盐溶性蛋白主要是肌原纤维蛋白，由肌球蛋白重链（MHC）、轻链、肌动蛋白和a-辅肌动蛋白等构成，在图中200ku处为肌球蛋白重链，而在45ku附近处则为肌动蛋白，凡纳滨对虾肌肉盐溶性蛋白分子量集中在200～45ku之间；水溶性蛋白在SDS-PAGE电泳中的条带不是十分清晰，而且部分成连续带状，出现了明显的带状染色，这可能是由于水溶性蛋白中含有的相近分子量蛋白比较多，分子量非常接近而使得在电泳中无法分开，出现模糊的蛋白条带只是在此分子量范围相对含量比较集中。因此，凡纳滨对虾水溶性蛋白集中分布在低分子量范围80～27ku之间。此测定结果与郑惠娜[20]等对马氏珠母贝蛋白分子量分布研究结果类似。

3 结论

凡纳滨对虾虾肉粗蛋白含量19.72%，脂肪含量0.82%，是典型的高蛋白低脂肪型食物。虾肌肉中各组分含氮量依次为：盐溶性蛋白＞水溶性蛋白＞基质蛋白＞非蛋白氮，各占肌肉总蛋白64.30%、25.00%、5.78%、4.92%。水溶性蛋白、盐溶性蛋白、基质蛋白和虾肉蛋白氨基酸种类齐全，组成理想，各蛋白氨基酸总量依次为：虾肉＞水溶性蛋白＞盐溶性蛋白＞基质蛋白，分别为：86.28、68.06、50.73、24.25g/100g，其中盐溶性蛋白和基质蛋白必需氨基酸达40.82%和41.81%，各蛋白的氨基酸比例存在一定的差异，但它们第一限制氨基酸类似。凡纳滨对虾基质蛋白分子量分布范围较宽，为200～19ku，水溶性蛋白分子量范围80～27ku，盐溶性蛋白分子量为200～45ku，肌球蛋白重链在200ku处，而在45ku附近处则为肌动蛋白。以上研究将为凡纳滨对虾高值化加工利用提供理论基础。

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Study on muscle protein composition and molecular weight distribution of Penaeus Vannamei

LAN Wei-bing1，2，MAO Wei-jie1，CHI An-ying1，2，JI Hong-wu1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；2.KeyLaboratoryofAquaticProductAdvancedProcessingofGuangdongHigherEducationInstitutions，Zhanjiang524025，China）

For the rational use of protein in Penaeus Vannamei，the muscle protein was separated.Amino acid composition was detected by amino acid analyzer and molecular weight was determined by SDS-PAGE electrophoresis.The results showed that the total protein content was（19.72±0.08）g/100g wet weight，and the proportion of salt-soluble protein，water-soluble protein，matrix protein，non-protein nitrogen was 64.30%，25.00%，5.78%，4.92%，respectively.There existed some differences in the proportion of each protein amino acid，but the first limiting amino acid was similar.The result of SDS-PAGE electrophoresis displayed that the molecular weight of salt-soluble protein，water-soluble protein，matrix protein were 200～45ku，80～27ku，200～19ku，respectively.

Penaeus Vannamei；protein separation；amino acid；molecular weight distribution

TS254.1

A

1002-0306（2012）09-0049-04

2011－08－02 *通讯联系人

蓝尉冰（1987-），女，硕士研究生，研究方向：水产品深加工。

国家虾产业技术体系建设（CARS-48）；科技部农业成果转化项目（2010GB2E000345）；广东省海洋渔业科技攻关重大项目（A201008102）；广东省科技团队项目（2011A020102005）。