GPR40反义RNA对胰岛β细胞内Ca2+浓度及胰岛素分泌的影响

周一军，李瑷，宋雨凌，李妍，周慧

（中国医科大学附属第四医院内分泌科，沈阳 1 1 0 0 3 2）

2型糖尿病患者由于肥胖、脂代谢紊乱常存在血浆游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）水平增高［1］，长期的FFA水平升高可导致胰岛素分泌障碍，是形成胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能减退的重要环节［2］。研究显示，GTP结合蛋白耦联受体40（GTP-binding protein coupling receptor 40，GPR40）是中长链 FFA的特异性受体，主要在胰岛β细胞和胰岛素分泌细胞系大量表达，介导了FFA对β细胞的多种作用。GPR40是1个7次跨膜受体，它是G蛋白耦联受体家族成员之一。GPR40以前从1个人类基因组片段中发现，曾被认为是1种“孤儿”受体（1种未知配体的受体），不发挥生理功能。最近研究发现，GPR40通过介导β细胞Ca2+信号反应参与了FFA刺激的胰岛素分泌。FFA作为胞外配体，通过激活胰岛β细胞的GPR40增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌［3~5］。

长期暴露在高水平FFA下，胰岛细胞长期大量分泌胰岛素而出现功能障碍，引起“脂毒性”作用，去除胰岛β细胞中的GPR40可以保护大鼠不患肥胖诱发的糖尿病。因此，如果能选择性地抑制胰岛β细胞膜上的GPR40受体表达，抑制其信号转导功能，则可以防止“脂毒性”作用的发生，进而大大降低糖尿病发生的可能性。本研究拟应用反义RNA技术特异性下调胰岛β细胞GPR40的表达，观察其对胰岛 β 细胞内 Ca2+浓度（［Ca2+］i）及胰岛素分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

成年SD大鼠，8~10周龄，体质量250~300 g，由中国医科大学实验动物中心提供。GPR40反义RNA真核表达载体 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）质粒由美国UniversityofTennesseeZhao博士惠赠；LipofectamineTM2000脂质体转染试剂，荧光染料探针Fura-2/AM购自Invitrogene公司；胶原酶Ⅴ、软脂酸、油酸均为美国Sigma公司产品；RPMI-1640购自Gibco公司，胎牛血清为Hyclone公司产品，GPR40抗体购自Santa Cruz公司；胰岛素放免检测试剂盒购自中国原子能科学院；RF-5000型双波长荧光分光光度计为日本岛津制造。1.2 方法

1.2.1 胰岛β细胞的分离纯化：成年SD大鼠，腹腔麻醉，剖腹，丝线接扎胆总管入十二指肠处，胆总管内插管，逆行灌注0.5 g/L胶原酶Ⅴ10 mL，分离胰腺，38℃水浴振荡10 min取出，冰浴中撕碎，继续38℃水浴振荡10 min后，D-Hanks液终止消化，重复1~2次，直到组织完全消化。500 μm筛网过滤消化液，D-Hanks液离心洗涤3遍，沉淀物制成悬液。离心管中，依次加入 250、200、110 g/L Ficoll分离液和胰岛悬液，3 000 r/min离心20 min，分层，吸出各界面细胞，D-Hanks液离心洗涤3遍，置入含胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、CO2培养箱培养。

1.2.2 GPR40反义RNA表达质粒转染胰岛细胞：将胰岛细胞以2×105/孔接种于24孔培养板上，按照脂质体介导法，取1 μg纯化的重组反义RNA表达质粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－），稀释于 50 μL 无血清培养液中；加入2.5 μL LipofectamineTM2000脂质体至50 μL无血清培养液中，室温静置20~30 min；将质粒DNA与脂质体的复合体按100 μL/孔加到24孔培养板中之后加入0.5 mL不含血清的培养液，轻轻摇动混匀，置入培养箱培养4 h后，移去转染复合物，加入无血清培养液孵育48 h；同时设置空白质粒转染组和对照组，每组设6个复孔。

1.2.3 免疫荧光染色：将各组胰岛细胞培养于盖玻片上，37℃下生长36 h后，加入4%多聚甲醛，室温下固定10 min，加入GPR40单克隆抗体，4℃孵育过夜，用TBS及TBST漂洗后3次，相应的二抗室温下孵育1 h，二抗被相应的带有Alexa F1uor 488546荧光所标记。用倒置荧光显微镜观察，未加一抗的阴性对照没有显示阳性染色。

1.2.4 Western blot检测GPR40表达：收集各组细胞，RIPA裂解液裂解细胞，离心收集上清。提取细胞总蛋白后，BSA法蛋白定量，10%SDS-PAGE电泳分离，转膜，室温下5%脱脂奶粉、TBST封闭液封闭1 h，加入特异性GPR40抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL显色系统显示蛋白条带，曝光、显影。用UVP凝胶影象分析仪测定蛋白条带浓度。

1.2.5 胰岛素测定：各组胰岛细胞培养48 h后，换用含软脂酸和油酸混合物（软脂酸∶油酸=2∶1，终浓度为1.0 mmol/L）的RPMI 1640培养液，分别作用胰岛细胞10、30、60 min后，置于浓度为 16.7 mmol/L的高葡萄糖培养液中，37℃、50 mL/L CO2培养箱孵育2 h，收集培养液，放射免疫法测定胰岛素水平。

1.2.6 测定［Ca2+］i：参照文献［6］的方法，将上述细胞悬液在37℃预温5 min后，加入Fura-2/AM（终浓度为5 μmol/L）37℃恒温振荡45 min。负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的温Hank液洗涤2次，最后调整细胞数为2×106/mL，测前细胞先于37℃复温2 min，采用荧光分光光度计测定荧光，测试参数如下：激发波长340 nm，裂隙宽度3 nm；发射波长500 nm，裂隙宽度 10 nm。用下面的公式：［Ca2+］i=Kd［（F-Fmin）/（Fmax-F）］（nmol/L）来计算［Ca2+］i浓度。Kd为解离常数（225 nmol/L），F为测得的荧光强度，Fmax为加入1%Triton X-100后，测得的最大荧光强度，Fmin为加入EGTA（10 mmol/L）后测得的最小荧光强度。

1.3 统计学处理

实验结果均以x±s表示，使用SPSS 11.5统计软件，多组样本均数间比较用方差分析，组间两两比较采用Dunnettt检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光染色结果

对照组和空白质粒转染组胰岛β细胞，在荧光显微镜下观察，细胞膜呈现绿色荧光，胰岛β细胞转染质粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）后，绿色荧光明显减弱（图1）。

2.2 GPR40反义RNA体外有效抑制胰岛细胞GPR40蛋白表达

Western blot结果显示，反义RNA转染组胰岛细胞中GPR40蛋白的表达水平显著低于对照组和空白质粒转染组，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组和空白质粒转染组GPR40蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，图2），结果显示反义RNA转染能够有效地下调胰岛细胞中GPR40的表达。

2.3 GPR40反义RNA对胰岛β细胞［Ca2+］i的影响

当加入软脂酸和油酸混合物时，引起对照组胰岛细胞［Ca2+］i升高分2个时相：即起始的短暂快速相和随后的持续相，快速相［Ca2+］i升高呈时间依赖性；同样软脂酸和油酸混合物升高空白质粒转染组细胞［Ca2+］i；而软脂酸和油酸混合物对反义RNA转染组细胞［Ca2+］i升高不显著，在各作用时间点，反义RNA转染组细胞［Ca2+］i显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。

2.4 GPR40反义RNA对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响

软脂酸和油酸混合物作用对照组胰岛细胞后，随作用时间增长，胰岛素分泌水平明显增加（P＜0.05），呈时间依赖性；软脂酸和油酸混合物同样升高空白质粒转染组胰岛素分泌水平，反义RNA转染组胰岛素分泌较其它组受到显著抑制，在各作用时间点，反义RNA转染组胰岛素水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

3 讨论

FFA短期作用能调节基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（glucose stimulated insulin secre－tion，GSIS）。长期FFA水平升高可导致胰岛素分泌障碍，甚至胰岛β细胞凋亡，即脂毒性作用，这是形成胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能减退的重要环节，直接参与糖尿病的发生发展。

表1 G P R 4 0反义R N A对胰岛β细胞内C a2+浓度的影响（n mo l/L，x±s）T a b.1 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n t h e［C a2+］i i n β-c e l l s（n mo l/L，x±s）

中长链FFA增强胰腺β细胞中由葡萄糖刺激产生的胰岛素分泌作用与GPR40的活化有关，已知中长链FFA是GPR40的内源性配体，一般认为有活性的是含有10~16个碳原子的饱和脂肪酸以及含有18~22个碳原子的不饱和脂肪酸。GPR40在胰腺中大量表达，它作为跨膜受体，可以接受细胞外FFA的刺激，通过信息转导机制，使得细胞外钙离子内流，放大GSIS［7~9］。本研究显示，在高浓度葡萄糖和Ca2+存在的环境下，软脂酸和油酸混合物可刺激大鼠胰岛细胞膜上的GPR40，导致细胞内［Ca2+］i显著升高，放大GSIS。FFA作为GPR40的内源性配体，通过一种全新的作用机制放大胰岛素的分泌。

表2 G P R 4 0反义R N A对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响（mmo l/L，x±s）T a b.2 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n i n s u l i n s e c r e t i o n i n β-c e l l s（mmo l/L，x±s）

反义RNA技术是近年发展起来的新型分子生物学技术，它是利用基因重组，构建人工表达载体，使其表达反义RNA，通过碱基互补与靶RNA配对结合，特异性封闭基因的手段［10］，在抑制有害基因表达或失控基因的过度表达中显示了良好的应用前景。本研究采用反义RNA技术，结果表明GPR40反义RNA转染能够有效地下调胰岛细胞中GPR40的表达，并且经过进一步研究发现，下调GPR40的表达可以显著抑制细胞内［Ca2+］i升高，同时GPR40反义RNA降低葡萄糖刺激胰岛素分泌水平。去除细胞膜上的GPR40，细胞内［Ca2+］i和胰岛素分泌水平将会大大降低，说明软脂酸和油酸混合物刺激放大的GSIS很大一部分经由GPR40实现信息转导。另外有实验表明，GPR40－/－小鼠能免于肥胖介导的高胰岛素血症、肝脂肪变和糖耐量减退，小鼠胰岛β细胞过度表达GPR40会损害β细胞功能［11］。研究结果表明，对于一些肥胖症患者，体内的高水平的FFA可能会引发糖尿病的发生，如果能找到一种高效的GPR40抑制剂，有选择性地和胰岛β细胞膜上的GPR40受体结合，抑制其信息转导的功能，则可以保护部分患者免受“脂毒性”作用，进而大大降低糖尿病发生的可能性。因此，研究GPR40的高效低毒的小分子拮抗剂，阻断GPR40的分子有可能用于新型抗糖尿病药物的开发，对于防治糖尿病具有非常重要的意义。

综上所述，FFA能够通过激活胰岛β细胞的GPR40增加GSIS，用GPR40反义RNA下调β细胞GPR40的表达，导致FFA介导的细胞内Ca2+应答及胰岛素分泌的显著抑制，提示GPR40通过介导β细胞Ca2+信号反应参与了FFA刺激的胰岛素分泌。

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