地高辛标记核酸病理形态学检测方法的建立及应用

杨雪，勾文峰，丁蕾，肖丽君，高野康雄，郑华川

（1.中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室，病理与病理生理研究所，沈阳 1 1 0 0 0 1；2.解放军4 6 3医院检验科，沈阳1 1 0 0 4 2；3.承德医学院基础部免疫教研室，河北 承德 0 6 7 0 0 0；4.日本神奈川县立癌中心临床研究所，横滨 2 4 1-0 8 1 5）

原位检测核酸的病理学方法主要有原位杂交（in situ hybridization，ISH）和原位 PCR（in situ polymerase chain reaction，ISP）。ISH利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法［1］。ISP通过PCR技术把固定在细胞内的RNA或DNA进行原位扩增，对靶核苷酸进行定位、定性、定量分析，该方法敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定性［2］。标准ISH的探测敏感度要求每个细胞中大约含有1 000个拷贝模板，而ISP则可检测到细胞中仅几个拷贝模板的核酸［3］。如果在ISP后再进行ISH可以大大提高组织切片上核酸检测敏感性，本研究拟探讨该方法的建立及操作注意事项，说明其在病理形态学检测中的应用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640或DMEM培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度的环境下，培养结直肠癌细胞系HCT115（低分化型腺癌）（日本东京物化研究所）或JC病毒感染的神经母细胞瘤（JCI）细胞（由北海道大学Sawa教授馈赠）。收集细胞，PBS洗2次，-80℃冻存，或常规制备成石蜡切片。

1.2 病理标本

收集日本富山大学医学部胃癌和肺癌组织各100例，10%甲醛固定，脱水、透明、浸蜡和包埋，制备成石蜡块，4 μm切片，展片到多聚赖氨酸处理的载玻片上烤片。所有患者手术前均未经放疗、化疗和生物治疗，获得患者及家属知情同意和大学伦理委员会批准。

1.3 探针制备

提取HCT115细胞RNA，AMV酶反转录成cDNA，制备地高辛标记的beclin 1和SERCA3探针；以pBluescrip K（+）-T抗原质粒为模板制备地高辛标记的JCV T抗原探针。所用引物见表1。100 μL PCR反应体系中含引物 F 1 μmol/L，引物 R 1 μmol/L，MgCl22 mmol/L，10×PCR buffer 10 μL，DIG-11-dUTP（Roche Diagnostics，德国）200 mmol/L，cDNA 模板100 ng，Taq聚合酶2 U。PCR反应条件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，循环30次。Reg IV探针长度为 122 bp （682~803，GI：36054181），PCR 产物经琼脂糖电泳后胶回收纯化。

1.4 ISH

4 μm厚切片脱蜡后，经胃0.05%蛋白酶（0.2 N HCl，pH2.0）37℃消化30 min，乙醇梯度脱水晾干。每张切片滴加1︰50稀释的20 μL地高辛标记的探针用杂交液（22 mmol/L Tris-HCl pH7.4，2.75 mmol/L EDTA、660 mmol/L NaCl、16 Denhardt solution、5.5%硫酸葡聚糖、0.33%二甲基亚砜、0.55%ethoquad 18/25和44%去离子甲酰胺），覆以盖玻片，95℃5 min，37℃过夜。TTBS冲洗10 min，滴加抗地高辛—抗血清碱性磷酸酶（Roche Diagnostics，德国），37℃20 min。冲洗5 min，浸入solutionⅡ（100 mmol/L Tris-HCl，pH9.5，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2），室温15 min，孵育抗地高辛—抗血清碱性磷酸酶过夜。NBT/BCIP显色液（紫色）或Fuchsin（红色）染色，核快红（粉红色）或甲基绿（绿色）复染。

1.5 ISP

10 μm 厚切片经蛋白酶 K（20 μg/mL，Dako）37℃消化15 min。PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定，2×SSC冲洗。滴加125 μL PCR反应体系（0.2 μmol/L引物，序列见表 1，0.125 nmol/L DIG-11-dUTP、2.5 mmol/L MgCl2，1×PCR buffer，6.25 U Taq 聚合酶），盖膜覆盖，94 °C 3 min 预变性，92 °C 15 s，55 °C 15 s，72 °C 30 s，循环 15 次，72 °C 5 min。扩增产物长度约100 bp。2×SSC 冲洗切片，滴加封闭液（100 μg/mL 鲑鱼精子 DNA，100 μg/mL 酵母 tRNA，5%BSA 溶于PBS中）作用1 h。检测和复染方法与ISH相同。

表1 制备探针或I S P所需引物T a b.1 P r i me r s e q u e n c e s f o r p r o b e o r I S P

2 结果

在ISH中，我们获得的地高辛标记探针DNA为单一条带，产物经过测序确认。切片经过酶消化后进行预杂交，使切片上细胞DNA双链解开。探针混入杂交液前要加热变性后立刻置于冰上，保证探针保持单链状态。甲酰胺杂交液中42℃杂交过夜后，洗掉杂交液并加入抗地高辛AP抗体，显色前经过碱性缓冲液改变切片上组织的pH值，使AP在最佳pH值发挥分解底物NBT/BCIP或Fuchsin的作用，核快红或甲基绿复染后直接干燥，然后浸入二甲苯中透明封片。切记甲基绿复染切片不能经过乙醇脱水，因为甲基绿溶于乙醇。如图1所示，JCV T抗原存在于JCI细胞的细胞核中，而在胃癌和肺癌细胞中未检测到JCV T抗原。如图2所示，beclin 1和SERCA3mRNA阳性信号也见于结肠癌和癌旁黏膜上皮细胞质中。

在ISP过程中，必须控制蛋白酶降解的时间，过度降解可能导致细胞形态受损。PCR反应液放入盖膜里之前要加热排除混合物中的气体后再加入Taq DNA聚合酶。如扩增的是组织切片，可将PCR反应液置于封口膜中。如扩增对象是细胞，还可以借助组织培养盖玻片操作。反应后，显示系统和ISH相同。如图1所示：JCV T抗原DNA存在于JCI细胞核中。此外，在肺泡上皮细胞和肺癌细胞核、胃癌及癌旁黏膜细胞核中也发现了JCV T抗原阳性信号（图 3）。

3 讨论

ISH探针的制备主要采用缺口平移法、随机引物法或PCR扩增合成，同位素标记探针的制备常用末端标记法。目前认为利用地高辛标记UTP进行PCR扩增较简便、安全，适合大多数实验室。ISH最关键的步骤是分子杂交，根据分子杂交的原理，在杂交过程中必须让探针和目标核酸处尽量处于单链状态。本研究所用杂交液中的甲酰胺可破坏氢键，使核酸解开双螺旋状态，硫酸葡聚糖的DNA有浓缩作用，可将杂交反应速度提高10倍以上。封阻DNA浓度通常为探针DNA的1~100倍，作用是杂交掉探针中的相似序列，阻止探针DNA与非目标DNA的粘连。杂交应在25℃（基因组ISH一般是37℃）、避光恒温条件下进行，持续时间12~20 h。在此期间应注意保湿，可将湿盒置于42℃温箱中，或将杂交炉上面的面板条浸湿。在检测mRNA表达的过程中，杂交过夜前一定要尽量保持RNase-free的操作条件。本研究中，在JCI细胞核中成功检测到JCV T抗原DNA，而在肺癌和胃癌组织中则未检测到，可能因其检测感度较低所致［4，5］。在结直肠癌细胞质中我们也检测到beclin 1和SERCA3mRNA的表达。我们的经验提示，如果结直肠癌组织样品进行RT-PCR 30个循环可以检测到目的基因，就能利用ISH成功检测到其mRNA表达。

ISP既有分子杂交特异、灵敏的特点，同时又有组织细胞化学染色的可见性，且其应用范围广泛，可对特定基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量［2］。本研究中，主要针对JCV T抗原DNA进行了ISP扩增，并在肺癌和胃癌细胞和癌旁正常细胞核中检测到其阳性信号［3~5］。ISP与ISH不同之处在于组织切片在PCR前要进行细胞固定，旨在保存细胞形态结构，本研究使用的4%中性多聚甲醛固定效果比较好。固定时间以30~60 min为宜，时间过长可能导致核酸和蛋白交联，影响PCR扩增效率。随后的蛋白酶消化的目的是解除醛类固定剂所致的核酸与蛋白质交联，防止形成网络性屏障结构，使得PCR反应试剂充分透入，同时也能更好地暴露DNA。PCR扩增产物长度不可过短或过长，产物太短容易扩散，而过长则扩增效率受影响。引物可用1对或多对，产物长度一般在100~200 bp。循环数应根据模板量进行适当调整，循环数过大可导致非特异性扩增，太小则易致假阴性。

本研究所用ISP为直接法，把标记核苷酸（如Dig-11-dUTP）直接混入PCR反应液中，随着扩增的进行，标记的核苷酸直接掺入到PCR产物中。还可采用间接法ISP，原位核酸扩增后进行ISH检测，可提高检测敏感度和特异度，但耗时较多。此外，还可行原位反转录PCR扩增，应注意的是组织要经过DNA酶处理去除细胞固有DNA，降低扩增模板噪声。在显色方面，无论ISH还是ISP，NBT/BCIP比Fuchsin的显色要强，Fuchsin显色过5 min后形成沉淀。

总之，为了获得敏感、特异和可信的结果，应根据研究条件选择核酸的原位检测技术，在实验过程中要注意实验原理和操作的关键点。本研究所建立的地高辛标记的ISH和ISP操作简便、敏感度高，NBT/BCIP显色和甲基绿复染的图像清晰，适用于大多数实验室。

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