遵义杜仲叶绿原酸提取工艺的优化研究

肖 苑，李文娜，黄燮南，陈 阳

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041)

遵义杜仲叶绿原酸提取工艺的优化研究

肖 苑，李文娜，黄燮南，陈 阳

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041)

目的优化杜仲叶中绿原酸的提取工艺。方法以绿原酸提取率为指标，通过单因素和正交实验优选提取方法与工艺参数。结果当乙醇浓度为60%、料液比为1∶12、pH=5、提取时间为30 min时，在超声频率25kHz的条件下提取2次，绿原酸的得率为2.54%,较用其他各组参数提取的得率高。结论杜仲叶中绿原酸的最佳超声提取工艺为：以60%乙醇为溶剂、料液比为1∶12、pH=5，提取时间30 min。

杜仲叶；绿原酸；提取工艺

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国常用的中药材之一，对杜仲的深入研究具有广泛的应用前景。已知杜仲叶与杜仲皮的化学成分，特别是药效成分基本一致【1】。因杜仲叶适当采收后可再发新叶，就实现资源的可循环利用而言，对杜仲叶中药物成分的研究、优化提取工艺、提高有效成分得率，具有十分重要的实际意义。绿原酸(chlorogenic acid)是杜仲叶中苯丙素类化合物的主要有效成分之一，具有抗氧化、保护心血管、抑制突变、抗菌抗病毒及抗肿瘤等作用【2】。为提高其开发利用价值，本文以贵州遵义产杜仲叶为原料，采用正交试验，对绿原酸的提取工艺进行了优化。

1 实验部分

1.1 仪器与试药 UV-2550紫外分光检测器(日本岛津)； HS3120型超声波清洗机(天津恒高有限公司)；HHW21-600型电热恒温水浴箱(北京长源实验设备厂)； FZl02微型植物试样粉碎机(黄骅市中兴仪器有限公司)； PHSJ-5型数显PH计(上海精密科学仪器有限公司)； 722型可见分光光度计(上海现科分光仪器有限公司)；杜仲叶(贵州省遵义市中药药材站)；绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 杜仲叶预处理和溶液配制 称取一定量干燥粉碎的杜仲叶，按料液比2∶5加入氯仿浸泡2次，每次4 h，抽滤自然风干备用。另取杜仲叶粗粉1.0g按本实验最佳提取工艺提取绿原酸，过滤，定容至50 mL，即为样品液。精密称取绿原酸对照品10 mg，置15 mL具塞试管中，用50%甲醇溶解，定容即得对照品溶液。

1.2.2 最大吸收波长的确定【3】精密吸取50 μl对照品溶液点于条形层析纸上，用水-醋酸-正丁醇(5∶l∶4)混合后的上清液作展开剂，饱和3.5 h后，上行展开，展距为15 cm时取出，并置低温、避光风干。然后在紫外光分析仪下以254 nm的波长观察，可见在Rf值为0.70 cm处出现淡蓝色斑点，剪下各荧光斑点，加入50%甲醇溶解定容至10 mL，超声震荡20 min。再在200～400 nm波长下进行UV扫描，此时可在327 nm处观察到最大吸收峰，故选择为测定波长。

1.2.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取5、10、15、20、25、30 μl对照品溶液，按“1.2.2”项下操作，用甲醇作空白对照，在波长327 nm下测定吸光度(A)，以A为纵坐标、绿原酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为：A=0.0359C+0.0029(r=0.9990)，绿原酸0.5～3.0 mg·L-1范围内与吸光度的线性关系良好。

1.2.4 加样回收率试验 在已知含量的杜仲叶粗粉中加入不同量的绿原酸对照品，按“1.2.2”项下操作同法测定吸光度，得绿原酸含量。其平均回收率为98.65%，RSD为1.88%，表明此法回收率较好。

1.2.5 不同提取工艺提取绿原酸对比 超声提取法【4】：精确称取杜仲叶干粉10g，用60%乙醇按料液比1∶8、pH=5，浸泡12 h，超声提取2次，每次40 min，然后抽滤，浓缩滤液。实验重复3次，检测绿原酸平均得率为2.16%，RSD 0.09%。

水提取法【5】：精确称取杜仲叶干粉10g，用双蒸水按料液比1∶25、pH=5、温度为65℃提取2次,每次90min，将滤液抽滤，浓缩。实验重复3次，检测绿原酸平均得率为1.57%，RSD 0.12%。

乙醇提取法【6】：精确称取杜仲叶干粉10g，用70%乙醇按料液比1∶16在90℃水浴中回流提取2次，每次1.5 h，再抽滤并浓缩滤液。实验重复3次，检测绿原酸平均得率1.93%，RSD 0.05%。

微波提取法【7】：精确称取杜仲叶干粉10g，在微波处理器中反复处理 3次，每次30S，再用超声波提取30 min，接着抽滤，收集滤液。残渣加400mL水重复提取1次，抽滤，浓缩滤液。实验重复3次，检测绿原酸平均得率为1.99%，RSD 1.03%。综上可见四种提取工艺中超声提取法绿原酸得率较高，且工艺稳定，因此本实验采用超声提取法提取绿原酸。

1.2.6 单因素考察提取工艺 为观察提取次数、乙醇浓度、料液比、超声提取时间与溶剂pH等因素对绿原酸得率的影响，先称取杜仲叶粗粉若干份，每份均为1.0g，进行下列实验：

提取次数的影响：取杜仲叶粗粉5份，按料液比1∶16加入70%乙醇，在pH=5，常温下超声提取，5份样本分别提取1、2、3、4、5次，每次40 min。测得的绿原酸得率分别为：1.87%，1.92%，1.92%，1.92%，1.92%。结果显示提取2次后，绿原酸得率开始趋于平缓。多次提取绿原酸的得率提高不明显，而工作量、生产成本提高，故实验采用2次提取。

乙醇浓度的影响：取杜仲叶粗粉6份，按料液比1∶16加入浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在pH=5，常温下提取2次，每次40 min，经测定滤液绿原酸含量发现其提取率分别为1.92%、1.95%、1.97%、2.12%、1.99%、1.92%。

料液比的影响：取杜仲叶粗粉6份，按料液比l∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14与1∶16加入50%乙醇，在pH=5，常温下提取2次，每次40min，过滤合并提取液，测定含量。绿原酸得率分别为1.97%、2.00%、2.02%、2.09%、2.10%、2.11%。

提取时间的影响：取杜仲叶粗粉6份，按料液比1∶12加入50%乙醇，在pH=5，常温下提取，时间分别为10、20、30、40、50、60min，各提取2次，合并滤液。测得绿原酸的提取率分别为：1.90%，2.02%，2.06%，2.07%，2.07%，2.08%。

溶剂pH的影响：先用酸调节50%乙醇的pH,使之分别为2、3、4、5、6等6种溶剂，然后按料液比为1∶12加入相应的6份杜仲叶粗粉中，在常温下提取2次，每次40 min，考察pH值对绿原酸得率的影响。测得绿原酸的提取率分别为：1.86%，2.08%，2.10%，2.13%，1.99%。结果显示乙醇浓度、料液比、超声提取时间、溶剂pH均对绿原酸提取有明显影响。

1.2.7 正交试验 选取超声提取法，频率为25kHz.根据单因素试验结果，提取次数为2次，将影响绿原酸提取效果的几个主要因素即提取时间(A)、乙醇体积分数(B)、料液比(C)、提取溶剂的pH值(D),进行正交设计，正交因素水平设计见表1。称取杜仲叶粗粉9份，每份1.0g，按正交表L9(34)安排正交实验,测定绿原酸的得率(见表2)。结果可见对提取因素影响大小顺序为:C>A>B>D，最佳工艺条件为 A1B3C3D2。

表1 因素水平表

表2 正交实验结果

1.2.8 最佳条件下的验证实验 称取杜仲叶粗粉1.0g在最佳条件下进行了3批验证试验，绿原酸平均得率为2.54%，RSD 0.98%。

2 讨论

本研究采用纸层析-UV分光光度法对绿原酸含量进行测定，可有效避免杜仲叶提取物中黄酮类物质对绿原酸的干扰而导致的测定结果偏差【8】。实验发现同等工艺条件下，四种工艺提取绿原酸的得率均低于文献报道。采用不同提取法杜仲叶中绿原酸得率的文献报道值如下：超声提取为2.61%【4】、水提为1.97%【5】、乙醇(70%)提取为4%以上【6】、微波强化提取为3.17%【7】。而我们采用上述文献相应工艺提取绿原酸的得率分别为2.16%、1.57%、1.93%、1.99%，均低于相应文献报道。究其原因可能与杜仲叶的产地、采收季节、采收时的树龄、绿原酸含量测定方法等因素有关。贵州遵义是杜仲的主产地之一【9】，并且当地原料中绿原酸的含量较高【10】，目前尚且没有成熟的提取工艺，为更合理利用这一宝贵资源，我们的研究目的在于优化超声提取杜仲叶中绿原酸的工艺。

考虑工业生产条件，本实验未采用加热方法，但超声时间过长，温度也会上升，会对绿原酸稳定性产生影响，所以我们还观察了超声提取过程中温度的变化。发现在10～60min内，超声提取时溶液温度仅在30～50℃变动，而绿原酸在此范围内化学性质稳定，故温度变化对绿原酸提取无影响。超声提取时不需加热，避免了醇提取与水提取需加热，以及微波瞬时高温对有效成分的不良影响，同时也节省了能源；超声提取还具有溶剂用量少，在提取过程中不发生化学反应，对绿原酸的生理活性无影响，有利于进一步分离纯化和不污染环境等优点。所以本实验选用超声提取工艺进行优化，并根据文献选择25kHz的频率。单因素考察提取工艺的结果表明，提取2次绿原酸得率较高，且节约工时和成本。另据单因素考察提取工艺结果，我们在乙醇体积分数、料液比、提取时间、溶剂的pH值等几个因素中各选出3个相邻的子因素进行考察。选择的原则是，以3个连续子因素所对应的绿原酸得率最高或较高，并适当考虑节省人力与物力。通过正交设计实验确定，超声(25kHz)提取法的最佳工艺条件为：用60%乙醇为溶剂，料液比1∶12， pH=5，提取时间30 min，提取2次。最佳条件下的验证实验结果表明，该提取工艺比较稳定,重现性良好。

【1】 Luo J,Tian C,Xu J,Sun Y.Studies on the antioxidant activity and phenolic compounds of enzyme-assisted water extracts from Du-zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves【J】.J Enzyme Inhib Med Chem,2009,24(6):1280-1287.

【2】 兰小艳,张学俊,龚桂珍.杜仲叶中绿原酸的研究进展【J】.中国农学通报,2009,(21):86-89.

【3】 齐惠丽.杜仲叶中绿原酸提取工艺研究【D】.天津:天津大学,2007.

【4】 齐惠丽,赵广荣,李东.杜仲叶中绿原酸的超声提取工艺研究【J】.西北药学杂志,2007,(6):300-301.

【5】 李光锋.杜仲叶中绿原酸的提取、纯化研究【D】.长沙:湖南农业大学,2006.

【6】 左航,黄文,李天宏,等.杜仲叶中绿原酸的提取条件优化及其提取物的降血脂作用【J】.林业科学,2009,(1):158-160.

【7】 李剑敏,卫兵兵,陈志红.微波强化提取杜仲叶中绿原酸的工艺研究【J】.应用化工,2006,35(4):243-245.

【8】 胡鲜宝,范贵生,吕加平.绿原酸提取纯化及检测方法的研究进展【J】.农产品加工学刊,2009,(11):85-88.

【9】 李新贵,黄小柱,林皎.遵义县杜仲采种基地营建技术及经营措施【J】.中南林业调查规划,2009,28(2):27-30.

【10】 邹小燕,李金华,葛发欢,等.高效液相色谱法测定不同产地杜仲叶的绿原酸含量【J】.中外医疗,2008,27(20):10-11.

StudyonextractiontechnologyofchlorogenicacidfromleavesofEucommiaulmoidesOlivinZunyi

Xiaoyuan,Liwenna,Huangxienan,Chenyang

(Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo optimize the extraction parameters of chlorogenic acid from leaves ofEucommiaulmoidesOliv.MethodsThe efficiency of extraction parameters was evaluated by detecting the chlorogenic acid extraction rate and the extraction parameters were optimized by single factor and orthogonal experiments.ResultsUsing ultrasonic (25kHz) extraction technology,when the powder of leaves ofEucommiaulmoidesOliv.was treated with 60% ethanol at a herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min,the highest extraction rate (2.54%) of chlorogenic acid was obtained.ConclusionThe optimal parameters of ultrasonic technology for chlorogenic acid extraction from the leaves ofEucommiaulmoidesOliv.are that 60% ethanol is used as solvent with the herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min.

leaf ofEucommiaulmoidesOliv;chlorogenic acid;extraction technology

贵州省中医药管理局项目(NO：QZYY-2010-60)；遵义医学院博士启动基金项目(NO：F-127)。

李文娜，女，博士,副教授,研究方向：心血管药理与新药研发，E-mail:lielizabeth@126.com。

R28

A

1000-2715(2012)05-0383-03

【收稿2012-05-24；修回2012-09-11】

(编辑：谭秀荣)