鸡源性肠炎沙门氏菌的鉴定＊

王 涛，王 亮，杜冬冬，庄燕飞，常维山

2.秦皇岛出入境检验检疫局，秦皇岛 066004

沙门氏菌是危害人类与畜禽等动物的一类病原菌，其血清型超过2 000个，我国已发现216个［1－2］。鉴于其危害性能够准确的鉴定沙门氏菌的基因型，对于沙门氏菌的防控与流行病学调查有重要意义。目前对于沙门氏菌的分类方法有多种比如分离培养、形态特征、生化反应和免疫学、16srRNA基因测序 方 法［3］，ERIC－PCR 方 法、随 机 扩 增 多 态 性DNA分型技术（RAPD）、基因外重复序列－PCR（rep－PCR）等。但是分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。16s rRNA 基因测序方法［3］，ERIC－PCR方法、随机扩增多态性DNA分型技术（RAPD）、基因外重复序列－PCR（rep－PCR）等方法存在准确率低、不能够实现全球互享等缺点而多位点序列分型技术解决了上述难题。多位点序列分型 （multilocus sequence typing，MLST）是一种通过直接测定多个管家基因的核苷酸序列来发现细菌变异的分型方法。它由Maiden等［4］于1998年首次运用于脑膜炎奈瑟菌的分型，后来由于其结果精确并且易于传递而广泛应用于其他致病菌、真菌以及一些非致病菌。MLST有两种分析方法，一种是以等位基因编号和ST编号为基本分析单位，还有一种就是直接分析核苷酸序列。选择哪种方法取决于所要分析的细菌群体的构成［5］在分析 MLST数据之前首先要确定所研究细菌群体的克隆程度，然后再根据需要选择相应的分析方法。目前该方法已广泛应用于霍乱弧菌、空肠弯曲菌、葡萄球菌、单增李斯特菌等细菌的分型研究［6－7］。本次试验主要运用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学、16srRNA基因测序方法［3］、多位点序列分型等鉴定方法对于临床上分离的一株沙门氏菌进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 由本实验室从患病蛋鸡肝脏中分离保存的一株鸡沙门氏菌

1.1.2 主要试剂 麦康凯琼脂、DHL琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂（均购自杭州天和微生物试剂有限公司）；沙门氏菌诊断血清（宁波天润生物药业有限公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物技术公司）；PCR产物凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司）；ExTaqDNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2KPlusⅡDNA Marker购自北京全式金生物科技有限公司；TGL－16B型微量离心机（上海安亭科学仪器厂）；JunYi JY200C型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司，76－0312－02）。

1.2 沙门氏菌分离增殖 取实验室分离保存的沙门氏菌先在非选择性蛋白胨水中进行非选择性增菌，再用亚酸盐胱氨酸增菌液进行选择性增菌培养。通过选择性增殖能够抑制沙门氏菌以外的其它细菌的生长。

1.3 沙门氏菌培养特性及形态学观察 分离菌接种于营养肉汤、麦康凯琼脂、普通营养琼脂、SS琼脂培养基、和血液琼脂，置于37℃恒温培养24h，观察细菌生长情况及菌落特征。将细菌纯培养物接种三糖铁琼脂，37℃培养24h。挑取培养基上可疑菌落涂片，革兰氏染色，镜检。沙门氏菌在不同培养基上面的生长状况不同，通过鉴别培养可以初步对沙门氏菌进行鉴定。

1.4 生化反应及血清学鉴定 参考以往的文献做了如下生化试验［8－9］将分离菌株接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇 、卫矛醇、尿素、硫化氢，并进行枸橼酸盐利用、吲哚试验和V－P试验等生化试验，置于37℃温箱培养，每日观察。

按照沙门氏菌诊断血清（60种）说明书（宁波天润生物药业有限公司），将临床所分离的沙门氏菌的培养物与沙门氏菌属诊断血清进行凝集试验，10 min内出现凝集者为阳性。

1.5 16srRNA基因序列分析法菌株鉴定 挑取单菌落接种在LB液体培养基中，37℃振荡培养12 h。用细菌基因组DNA提取试剂盒严格按照说明书进行DNA组提取，－20℃保存备用。用正向引物 27F5－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3和反向 引 物 1492R5－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3扩增细菌16sRNA基因。

PCR扩增体系：10×buffer 2.5μL；Mg2＋2 μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；模板 DNA 0.5μL；dNTP 0.5μL；双蒸水18.3μL；ExTaq DNA聚合酶0.2μL。

扩增条件：94℃ 预变性10min（94℃变性50 s，55℃退火50s72℃延伸1min 50s，30个循环）72℃延伸10min。

PCR产物按照PCR产物凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由上海生物工程有限公司进行测序。

1.6 管家基因位点的扩增 7个管家基因分别为thrA、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、aroC根 据PubMLST（http：//pubmlst.org）及ncbi上公布的基因片段设计引物如表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 7个管家基因引物序列Tab.1 Sequences of all primers used in the 7housekeeping genes

PCR扩增体系：10×buffer 2.5μL；Mg2＋2 μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；模板 DNA 0.5μL；dNTP0.5μL；双蒸水18.3μL；ExTaq DNA聚合酶0.2μL。

扩增条件：94℃ 预变性10min（94℃变性50 s，54℃退火50s72℃延伸1min 30s，30个循环）72℃延伸10min。

PCR产物按照PCR产物凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由上海生物工程有限公司进行测序

1.7 测序结果比对 序列测定结果使用DNA Star软件根据Pub MLST［10］规定进行修正；7个管家基因测序结果与Pub MLST数据库进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型。

2 结 果

2.1 分离株培养特性 分离菌在营养琼脂上呈圆形、微隆起、光滑湿润、半透明、边缘整齐、针尖大小、露珠状的小菌落。在麦康凯琼脂上长出无色透明、圆形的小菌落。在鲜血琼脂上不溶血。在SS琼脂上成无色透明小菌落。肉汤培养基呈均匀混浊，管底有少量沉淀物。三糖铁培养基斜面为红色，底层为黑色。革兰氏染色该细菌呈红色小杆菌。

2.2 分离菌生化特性 如表2所示该细菌能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、卫矛醇、山梨醇和产生硫化氢；不能发酵乳糖、蔗糖；V－P试验、吲哚试验、尿素试验、枸橼酸铵盐利用试验均为阴性。根据《伯杰氏手册》［10］关于肠炎沙门氏菌生化反应特征的标准，该株细菌符合肠炎沙门氏菌的生化特征。

表2 分离菌生化试验结果Tab.2 Results of bacteria biochemical test

2.3 分离菌血清学试验结果 分离菌抗原式为O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），根据《伯杰氏手册》［10］关于肠炎沙门氏菌血清学抗原式的规定，该株细菌符合肠炎沙门氏菌抗原式。

2.4 16sRNA扩增测序结果 经过16sRNA扩增测序，凝胶电泳扩得大小为1 467bp的目的片段如图1所示。其序列在ncbi比对结果与肠炎沙门氏菌P125109（NC＿011294.1）同源性为100%。

2.5 管家基因扩增结果 如图2所示7个管家PCR皆扩增到大小一致的目的片段，sucA目的片段大小为643bp；thrA目的片段大小为628bp；dnaN目的片段大小为615bp；hemD目的片段大小为587bp；pure目的片段大小为480bp；hisD目的片段大小为755bp；aroC目的片段大小为833bp。

图1 16sRNA扩增结果Fig.1 PCR product of 16sRNA

图2 管家基因PCR结果Fig.2 PCR product of housekeeping gene

2.6 肠炎沙门氏菌 MLST分型结果 对于上述7个管家基因胶回收目的片段交由上海生工测序，测序结果经整理后上传国际MLST网络数据库。经与数据库中沙门氏菌7个管家基因比对得出如表3结果，该株肠炎沙门氏菌基因型为ST11。

3 讨 论

本次试验对于临床上分离细菌运用培养特性、细菌形态、生化试验、血清学鉴定、16sRNA鉴定、多位点序列分型等试验方法进行了鉴定。培养特性、细菌形态、生化试验鉴定结果显示该株细菌符合《伯杰氏手册》［10］关于肠炎沙门氏菌的生物学特性。血清学试验结果显示该株细菌抗原式为O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），符合《伯杰氏手册》［10］上关于肠炎沙门氏菌鉴定的抗原式。16sRNA测序鉴定结果与GenBank上比对，该株肠炎沙门氏菌与肠炎沙门氏菌标准株P125109（NC＿011294.1）同源性100%。该株肠炎沙门氏菌多位点序列分型结果显示，该株肠炎沙门氏菌基因型号为ST11。最终确定该株细菌为肠炎沙门氏菌，抗原式为O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），ST11。据报道鸡肠炎沙门氏菌P125109最早分离自蛋鸡。本次是创新点在于运用多种试验方法对临床上分离的1株沙门氏菌进行分类，并且运用了目前细菌分类学中比较准确的方法多位点序列分型法。

表3 MLST结果Tab.3 Results of MLST

本次试验运用了多位点序列分型方法对临床分离株肠炎沙门氏菌进行了分型，分型结果与国际MLST网络数据库中有关肠炎沙门氏菌流行情况进行了比对。比对发现肠炎沙门氏菌ST11基因型在中国、欧洲、美国等地都有发现，其存在于人类体内、鸡体内、食物中。英国的一项调查表明，肠炎沙门氏菌 和鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）感染占到人类沙门氏菌感染病例的75%以上［11］；日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙门氏菌引起的，其中主要病原菌为肠炎沙门氏菌。

多位点序列分型可以准确定位不同细菌的系谱，并且可以通过管家基因比较确定细菌间的遗传差异，准确率高［12－16］。多位点序列分型是在 DNA分子水平的细菌分型方法，多选择6～7个管家基因进行序列分析。对于同一基因必须选择同一引物进行扩增所以必须选择高度保守的管家基因。MLST是一种高分辨力的分型方法，适合长期大范围、全球性的流行病学调查研究［17］。

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