登革病毒IgM抗体快速检测试纸条检测效果的初步研究＊

翁育伟，张长弓，王金章，林梅清，黄 萌，严延生

2.福建省人兽共患病研究重点实验室，福州 350001；

3.福建医科大学公共卫生学院，福州 350004；

4.厦门波生生物技术有限公司，厦门 361000

登革热（dengue fever，DF）是一种由媒介传播的病毒性传染病。在过去的50年间，随着登革热在全球迅速扩散，登革热的发病率上升了30倍。据估计，目前全球每年约有5千万人感染登革病毒。在全球，登革热流行区域已经波及到热带、亚热带100多个国家和地区，对经济和社会造成巨大负担是全球性的公共卫生问题［1］。近年来，随着对外经贸、旅游的不断发展，国内报告输入性登革热病例也不断增加，在东南沿海省份，还不时发生由输入性病例导致的登革热暴发流行［2－4］。鉴于登革热的流行态势及其潜在危害，我国已将登革热列为重点防控的传染病之一。

疫苗是预防和控制登革热最有效的手段，但截至目前，全球尚无登革热疫苗面市。因此，快速可靠的实验室检测在登革热诊断、治疗以及DF的预防控制中具有重要的作用。登革热实验室检测方法主要包括登革病毒分离、病毒核酸检测以及病毒抗体或抗体的血清学检测等，但几种方法各有局限性［1］。比如，病毒分离是实验室检测的金标准，但需要较长的检测周期且检测的敏感性不高，病毒核酸虽然具有敏感性、特异性高的优点，但对设备和检测人员的素质要求较高。登革热的实验室检测还受病程的影响，根据发病后不同的时期，需采用不同的检测方法。相对于恢复期病例而言，急性期病例的诊断对登革热治疗、预防和控制更为重要。在几种登革病毒诊断方法中，基于胶体金标记的免疫层析检测法（immuno－chromatography test）因具有简便、快速、无需复杂仪器设备、人员要求不高等特点，除适合于实验室开展常规抗体检测外，在暴发疫情的现场处置中更是具有不可比拟的优势。但截至目前，除国外主要试剂生产商有此类试剂面市外，国内尚未见有类似试剂上市并应用于检测工作中。在本研究中，我们利用在大肠杆菌中表达并具有免疫活性的1－4型登革病毒的外膜重组蛋白［5］，组装胶体金免疫 层 析 试 纸 条 （immuno－chromatography strip，ICS），利用采集自备的血清盘，初步分析该试剂的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料 登革病毒1－4型重组蛋白由本实验室制备［5］。登革病毒IgM抗体胶体金试纸条由厦门波生生物技术有限公司组装，其中血清型特异性膜条使用单一型别重组抗原组装，通用膜条的使用4种重组抗原混合组装。对照试剂采用IgM抗体捕获法检测试剂（Dengue IgM capture ELISA，澳大利亚Panbio公司），测试用阳性血清采集自登革病毒感染者，阴性血清采集自健康体检者，疟疾、钩端等其它传染病患者急性期血清为本室保存。病毒核酸抽提及RT－PCR试剂购置QIAGEN公司，Ex Taq酶、DNA marker等购自TaKaRa公司（大连）。

1.2 方法

1.2.1 血清样品的采集和保存 使用无抗凝剂的真空采血管采集登革病毒感染者外周血，室温放置1h后，1 000r/min离心10min，收集血清，置于－20℃保存备用。其中登革1型感染者血清采集自2004年福建省登革热暴发［2］病例（除1例散发病例外）；登革2型感染者血清分采集自2007年福建省登革热暴发［3］期间的病例；登革3型和4型病毒感染者血清采集自2004－2012年间福建省发现的输入性散发病例，所有阳性血清均经IgM抗体捕获法ELISA证实。据流行病学调查资料，所有病毒感染者均为初次感染，无2次感染病例。对照血清采集自健康体检者血清。测试用血清样品情况见表1。

表1 本研究使用的血清样品Tab.1 Composition of serum panel used in this study

1.2.2 病毒型别鉴定 取140μL急性期（发病至采样时间≤7d）血清，按RNA mini kit（QIAGEN）说明书提取病毒核酸，按Lanciotti等［6］方法做反转录套式PCR，根据病毒核酸扩增结果判定病毒型别。部分病例血清为≥7d的恢复期血清，其型别根据配对的急性期血清的RT－PCR结果判定。

1.2.3 IgM 抗体捕 获法 ELISA（IgM antibody capture ELISA，Mac ELISA）检测 采用Panbio公司的Dengue IgM Capture ELISA试剂，按试剂说明书操作检测血清样品中的IgM抗体，其中，Index value＞1.1者判为阳性，≤1.1者判为阴性。

1.2.4 胶体金免疫层析法检测 登革病毒IgM胶体金免疫层析试纸条由厦门波生生物技术有限公司组装，按说明书操作。其中，对照线和检测线同时显色判为阳性，仅对照线显色判为阴性，对照线不显色则判为实验无效。结果观察在15min内完成。

1.2.5 统计分析 两种检测方法结果的比较采用配对χ2检验，检测方法一致性采用Kappa分析。

2 结 果

2.1 通用型ICS检测结果 应用4种血清型混合抗原组装的通用型ICS的检测结果见表2。在Mac ELISA检测阳性的69份标本中，ICS检出阳性59份，Mac ELISA检测阴性的111份标本中，ICS检出阳性104份。以Mac－ELISA为参照，ICS的敏感性为85.5%（59/69），特异性为93.7%（104/111）。ICS与Mac ELISA两种检测方法的符合率为90.56%，两种方法检测结果的配对χ2检验表明，差异没有统计学意义（P＝0.629），两种检测方法具有较高的一致性（Kappa＝0.799）。

2.2 分型ICS检测结果 自血清盘中筛选 Mac ELISA法检测阳性且RT－PCR结果阳性的血清标本28份，其中D1、D2型各10份，D3型7份，D4型1份。应用各型抗原单独组装的试纸条检测IgM抗体，分型检测结果表明，ICS型内IgM的检测阳性率为42.9%～100%，而非对应型别的抗体检测阳性率为0%～33.3%。除D1型外，其它各型ICT均可检出对非对应型别的IgM，表明分型ICS具有型间交叉反应。

2.3 通用ICS检测其它病原体感染者血清 在180份血清中，有33份为其它方法确诊的流行性出血热（n＝13）、钩端螺旋体（n＝8）、恙虫病（n＝8）、疟疾（n＝4）患者血清标本，统计分析通用型ICS和Mac ELISA方法测试结果，结果表明，ICT通用型试纸条检测的总体假阳性率（6/33）小于 Mac ELISA法（9/33），然而，ICT通用型试纸条对上述4种传染病均存在交叉反应，而Mac ELISA检测钩体病时未出现交叉反应现象，见表4。

表2 免疫层析法和捕获ELISA法检测结果比较Tab.2 Comparison of ICS and Mac ELISA test

表3 免疫层析法分型检测结果Tab.3 Sero－typing test results of ICS

表4 两种方法的交叉反应检测结果Tab.4 Cross－reactive antibody tested by two methods

3 讨 论

登革病毒可分为1－4种血清型，任一种血清型病毒感染均可造成发热、出疹、骨骼肌肉疼痛等典型的登革热症状，严重者还可导致登革出血热和登革休克综合征；在感染早期，病毒在单核细胞内迅速增殖并释放到血液中，形成病毒血症，在特异性免疫建立后，病毒才可得以逐步清除。因此病毒感染者在特异性抗体产生之前，将首先经历病毒血症期，此时感染者血液中可以查到高滴度的病毒以及病毒非结构蛋白（nonstructural protein 1，NS1）；处于病毒血症期的感染者可通过伊蚊等媒介的叮咬将病毒传给健康人，这是病毒在人群中传播和扩散的主要途径。因此，在选择和建立登革热检测方法和试剂时，应考虑到上述特点。良好的检测试剂除了具备相当的敏感性和特异性外，还应具备：可以检测所有4种型别的登革病毒感染；可以在感染的急性期检出病毒核酸、抗原、抗体或等特异性靶标；在实际应用中，应尽量便捷、快速。

本研究建立的登革病毒IgM抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法，除满足上述要求外，还尝试增加病毒血清学分型的功能，其原理是应用登革病毒外膜蛋白DIII区的型特异性表位来检测型特异性抗体，从而达到分型的目的。血清学分型的目的是为了使实验检测结果更好地应用于疾病控制，比如病毒传染源的追踪、回顾性调查等工作中。从此次小样本检测的结果来看，通用型试纸条的检测结果与Panbio公司的Mac ELISA方法的检测结果的一致性程度较高（Kappa＝0.799）。Panbio公司的Mac ELISA是目前市面上使用最为广泛的试剂之一，具有较高的敏感性和特异性［7］。因此，本研究制备登革病毒IgM抗体胶体金免疫层析试纸条具有进一步改进和应用的价值。从分型检测的结果看，除了D1型试纸条可以清晰的判定对应的型别，其它型别的试纸条均不能很好地区分病毒的型别，其中的原因可能是我们所使用的重组抗原材料中，存在除型特异性表位外还包含有型交叉反应性表位［8］。有研究［7－9］表明，检测登革病毒IgM 抗体时，可能与其它病原体抗体产生交叉反应，因此我们选取了部分流行性出血热、恙虫、钩体病、疟疾等病例血清用于测试ICS试剂的交叉反应情况，结果表明，与Mac ELISA比较，ICS法的交叉反应较低，但ICS可能与更多的病原体抗体产生假阳性反应。尽管这个结论需要更大样本量的测试，但至少提示，在登革病毒抗体的检测中，交叉反应问题应当引起重视。

目前，国外针对登革病毒早期诊断的试剂已经得到较为完善的发展，除了病毒抗体的检测试剂外，还发展了包括NS1抗原检测在内的多种检测试剂［10－11］，而国内登革热的检测试剂研发尚处于起步阶段，缺乏具有竞争力的产品，特别是在快速检测试剂方面，与国外尚有较大的差距，本研究目的是利用本实验室表达的重组抗原，研制快速检测试剂，用于替代进口产品，服务于我国的登革热防控工作。本研究所制备的通用型检测试纸条具有一定的潜力，后期我们将对其进行进一步的改进，并使用大样本量的标本评价其应用效果。

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