树突状细胞DNA多价疫苗抗日本血吸虫感染作用机制的研究＊

血吸虫病是一种流行广泛、严重危害人体健康并影响畜牧业生产的人兽共患寄生虫病。作为吡喹酮化疗的补充，血吸虫病疫苗的研究是一种更有效的控制措施。血吸虫病疫苗的研究已有半个多世纪，历经死疫苗、减弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗四个阶段。尽管血吸虫病疫苗的研究工作已取得一定的进展，但离实际应用尚有一定的距离，增强DNA疫苗的免疫效果便成为当前血吸虫病疫苗研究的焦点，有必要进一步加强对血吸虫的生物学特性、血吸虫与宿主的相互关系以及混合抗原、细胞免疫、疫苗免疫方法、免疫途径、佐剂应用等基础方面的研究［1］。

树突状细胞（DC）是体内功能最强的一种专职抗原提呈细胞，在机体免疫应答中起着核心作用。由于其独特的功能，DC目前广泛应用于抗感染、肿瘤、自身免疫病和移植免疫等［2－3］。作者此前已成功地将Sj26、Sj23和Sj14基因分别转染至小鼠DC，并在DC中得到稳定表达，联合免疫具有明显的协同或增强作用，本研究在此基础上对其保护性免疫机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 DC细胞株MTSC4（北京医科大学免疫学系陈慰峰教授惠赠），常规方法培养传代；BALB/c小鼠，6～8周龄、雌性（武汉市生物制品研究所）；小鼠白细胞介素－4（IL－4）和干扰素－γ（IFN－γ）检测试剂盒（英国BD Biosciences Pharmingen公司）；噻唑蓝MTT（美国Invitrogen公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；HRP标记羊抗鼠IgG（美国Bio－Rad公司）；RPMI－1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青公司）。

1.2 方法

1.2.1Sj26基因转染 DC、Sj23基因转染 DC、Sj14基因转染DC、pcDNA3转染DC的制备与培养 参照文献［4］制备，按常规方法培养传代。

1.2.2 动物免疫 BALB/c小鼠随机分为7组，每组12只。A组为Sj26、Sj23、Sj14基因转染DC，B组为Sj26基因转染DC，C组为Sj23基因转染DC，D组为Sj14基因转染DC，E组为空质粒pcDNA3转染DC，F组为未处理DC，G组为RPMI－1640对照组。免疫前用RPMI－1640培养液洗涤细胞2次，0.25%胰蛋白酶分别消化各组DC，调细胞浓度为1×106/mL。A－F组，每只小鼠分别经耳廓注射0.2 mL细胞悬液，G 组注射0.2mL RPMI－1640培养液。共免疫3次，间隔2w。末次免疫后第2w，每鼠经皮肤感染40条日本血吸虫尾蚴。

1.2.3 血清特异性IgG抗体检测 收集初次免疫前、末次免疫后第2w以及攻击感染后第6周各组小鼠血清，ELISA法检测特异性IgG抗体。可溶性虫卵抗原（SEA）以10mg/mL包被酶标板，待测血清稀释度为1∶100，HRP标记羊抗鼠IgG工作浓度为1∶1000，底物为邻苯二胺，终止反应后用酶标仪测定吸光度（A491）值。

1.2.4 血清细胞因子IFN－γ和IL－4检测 按照IFN－γ和IL－4检测试剂盒操作说明书，ELISA法分别检测初次免疫前和末次免疫后第2w小鼠血清细胞因子水平。待测血清稀释度为1∶10，酶标仪测定吸光度（A450）值。根据同一酶标板上的标准曲线，计算待测样品中相应的细胞因子水平。

1.2.5 IFN－γ和IL－4的诱生及检测 攻击感染后第6w，无菌取小鼠脾脏，常规法制备脾淋巴细胞悬液。以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液调细胞浓度为5×106/mL，加至24孔细胞培养板中，1 mL/孔，每份样本设3孔，分别加入RPMI－1640培养液、SEA（10μg/mL）和 ConA（5μg/mL），37℃、5%CO2培养箱中孵育72h，14 000×g离心10min，收集上清液。双夹心ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞诱生的IFN－γ和IL－4水平。

1.2.6 脾淋巴细胞增殖试验 将脾淋巴细胞加至96孔细胞培养板中，细胞数为2×105，200μL/孔，分别加入SEA（10μg/mL）和ConA（5μg/mL），同时设立 RPMI－1640培养液阴性对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育72h，终止培养前，每孔加入MTT 10μL，混匀后继续培养6h。吸去上清，加入DMSO 100μL/孔，振荡以充分溶解甲肷产物，酶标仪测定吸光度（A560）值。按公式计算刺激指数（SI），SI＝刺激孔A560均值/对照孔A560均值。

1.2.7 统计分析 用SAS软件包对数据进行ANOVA检验和t检验。

2 结 果

2.1 血清特异性IgG抗体水平 末次免疫后第2 w，A－D组小鼠血清特异性IgG抗体水平较免疫前显著升高，且明显高于E和F组（P＜0.05）。感染后第6w，各组小鼠血清抗体水平差异无统计学意义（表1）。

2.2 血清IFN－γ水平 免疫后，A－D组小鼠IFN－γ水平较免疫前明显增高（P＜0.01），且明显高于E和F组（P＜0.01）（表2）。

表2 各组小鼠血清IFN－γ水平的比较Tab.2 Comparison of IFN－γlevels in sera from each group of mice

2.3 血清IL－4水平 免疫前、后各组小鼠血清IL－4水平差异无统计学意义（表3）。

2.4 脾淋巴细胞IFN－γ的诱生 A－D组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激诱生的IFN－γ水平显著高于G组（P＜0.001），E和F组在ConA和SEA刺激下产生的IFN－γ水平与G组相比，差异均无统计学意义（表4）。

2.5 脾淋巴细胞IL－4的诱生 A－D组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激诱生的IL－4水平明显低于G组（P＜0.001），E和F组在ConA和SEA刺激下产生的IL－4水平与G组相比，差异均无统计学意义（表5）。

2.6 脾淋巴细胞刺激指数 小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后的刺激指数，A－D组明显高于G组（P＜0.001），E和F组的刺激指数与G组相比，差异均无统计学意义（表6）。

表3 各组小鼠血清IL－4水平的比较Tab.3 Comparison of IL－4levels in sera from each group of mice

表4 各组小鼠脾淋巴细胞IFN－γ的诱生Tab.4 IFN－γresponses of spleen lymphocytes from each group of mice

表5 各组小鼠脾淋巴细胞IL－4的诱生Tab.5 IL－4responses of spleen lymphocytes from each group of mice

表6 各组小鼠脾淋巴细胞刺激指数Tab.6 Stimulating index of spleen lymphocytes from each group of mice

3 讨 论

日本血吸虫病疫苗候选抗原可分为7大类，酶性抗原（谷胱甘肽S转移酶、磷酸丙糖异构酶）、肌球蛋白抗原（副肌球蛋白）、膜相关蛋白（Sj23）、钙相关蛋白（脂肪酸结合蛋白、钙蛋白酶、钙网蛋白）、线粒体相关蛋白、性别相关蛋白、信号蛋白（Sj14－3－3）等［5］。迄今为止，单价抗感染疫苗候选分子诱导的保护力很少超过50%，究其因，一是由于血吸虫感染后保护性免疫机制复杂多样，包括体液免疫和细胞免疫，并有其它细胞和补体等的参与，不同的抗原分子诱导的保护性免疫机制不同，而不同虫期的保护性抗原的特异性亦不同，人们对于血吸虫感染后的免疫机制目前尚不完全清楚；其二是血吸虫是一种多细胞生物，且生活史复杂，抗原成分多样，由于血吸虫与宿主在长期共进化过程中，产生了多种免疫逃避机制，使得疫苗的研制未能获得理想效果；其三是由于DNA疫苗免疫原性较弱，对CD＋8T细胞和CD＋4T细胞的刺激作用均较弱［6］。

多价DNA疫苗可增加有效的抗原决定簇数量，模拟血吸虫自然感染，能刺激机体产生更多的保护性抗体和激活更多效应T细胞，获得较好的免疫效果。DC是体内功能最强的抗原提呈细胞，在刺激免疫反应中起着核心作用，能刺激T淋巴细胞，尤其是初始T细胞。尽管DNA疫苗仅能直接转染较小一部分的DC，但是实验研究发现在引流淋巴结中的所有DC均能被广泛激活，从而为效应T细胞的活化提供了最佳条件，DNA疫苗若能以DC为载体可望获得良好的免疫效果［7］。因此，寻找新的疫苗候选分子、联合一种或几种有效抗原分子制成混合多价疫苗、结合佐剂的应用等提高疫苗分子的免疫效果的研究，是当前血吸虫病疫苗研究的主攻方向［8］。

研究证实，机体抗血吸虫感染的保护性免疫与Th1型细胞介导的免疫应答有关，发展以Th1型优势免疫应答为主的疫苗，将是高效血吸虫病疫苗研制的关键。本研究结果表明体液免疫和细胞免疫共同参与了DC DNA混合多价疫苗诱导的保护性免疫作用，DC DNA混合多价疫苗诱导的抗日本血吸虫感染的保护性免疫，与小鼠Th1型免疫应答的增强有关，为血吸虫病疫苗的研究打下了基础。

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