一起由非脱羧勒克菌引起食物中毒的调查和实验室检验与分析

伍海燕 宋燕 张萍 姜照 王培娟 王彦青 宁文吉 韩文清▲

1.山东省烟台市疾病预防控制中心，山东烟台 264003；2.山东省烟台市开发区疾病预防控制中心，山东烟台 264006

一起由非脱羧勒克菌引起食物中毒的调查和实验室检验与分析

伍海燕1宋燕1张萍1姜照1王培娟2王彦青1宁文吉1韩文清1▲

1.山东省烟台市疾病预防控制中心，山东烟台 264003；2.山东省烟台市开发区疾病预防控制中心，山东烟台 264006

目的对一起食物中毒的采集样本进行相关微生物学检验，确定引起食物中毒的病原菌，并进行16S rRNA序列分析确定其归属。方法根据流行病学调查及临床表现，选择疑似的病原菌，根据GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010、WS/T9-1996、《卫生防疫细菌检验》对采集的样品进行病原菌分离与鉴定，对菌株的16S rRNA基因测序结果进行分析。结果从1份疑似中毒食物鱼香茄子中检出非脱羧勒克菌，该菌株属于阿氏肠杆菌。结论综合流行病学调查、临床资料和实验室检测结果，提示该次食物中毒由非脱羧勒克菌污染食物所致。

食物中毒；非脱羧勒克菌；污染

非脱羧勒克菌是属于勒克菌属中唯一的菌种，在1986年提议命名，是一种罕见的肠杆菌科细菌，该细菌能够在动物、植物、食物和水等环境中生存，也能在一些临床样本中分离到，如血液、粪便、痰液和尿液等。非脱羧勒克菌在一定条件下可以成为对人体具有致病力的病原菌，并与人类腹泻关系密切，有报道曾在腹泻患者粪便和痰液中检出，对小白鼠有一定致病力[1]。

1 流行病学调查

2011年8月3日山东省烟台市疾病预防控制中心接到报告，本市某企业餐厅就餐职工相继出现腹泻、腹痛、呕吐等症状。该公司位于烟台市区西部，现有员工约8万人，公司园区供餐场所共计57个，厂区有员工餐厅37个，中央厨房3个，主要有3家餐饮供应商。首发病例时间为2011年8月2日12∶00时左右，发病高峰出现在同年8月3日00∶00～9∶10，此时间段共有42例发病。截至8月3日15∶00共有45例发病，潜伏期12～30 h。45例发病者主要临床症状为腹泻45例，腹痛43例，恶心39例，呕吐32例，呕吐次数以3～5次/d为主，部分患者有发热症状，少数头痛、头晕，症状较轻，但反复迁延，未出现异常神经和精神症状。腹泻物性状以黄色米泔水样便为主，腹泻次数以3～10次/d为主，腹痛主要为上腹部和脐周绞痛，经及时补液和抗菌治疗后发病者情况均逐步缓解。

2 方法与结果

2.1 样品来源

流调现场采集179份剩余食物样品，10份大便，2份呕吐物。

2.2 培养基试剂及诊断血清

本次试验用培养基、生化试剂均来自北京陆桥技术责任有限公司；肠杆菌科和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒ID32E，由法国梅里埃提供；沙门菌属诊断血清、志贺菌属诊断血清均由宁波天润生物药业有限公司提供。Taq DNA聚合酶、dNTPsDNA、Marker、pmD18-T载体均购自Takara公司；全血基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于天根公司；DH5ɑ购自大连宝生物公司。所有培养基和试剂均在有效期内使用。

2.3 检验项目和方法

根据流行病学调查及临床表现，主要检测沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌。检测方法按GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010《中华人民共和国国家标准——食品卫生微生物学检验》[2]和《卫生防疫细菌检验》[3]对采集的样品进行检测，同时采用法国梅里埃ATB微生物自动鉴定系统进行细菌鉴定。

2.4 病原菌分离鉴定[4]

2.4.1 分离培养将采集的样品直接划线接种HE平板、TCBS平板、哥伦比亚血平板；同时分别接种缓冲蛋白胨水（BPW）、GN增菌液、7.5%氯化钠肉汤、3%氯化钠碱性蛋白胨水，18～24 h增菌培养后划线接种以上选择性平板。培养后接种的相关选择性培养基上未发现沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌的可疑菌落，但在HE平板上发现了菌落形态一致的疑似志贺菌菌落。

2.4.2 生物特征在HE平板上的典型菌落较小，圆形、光滑、凸起、透明、无色。挑起HE平板上的可疑菌落接种TSI斜面培养18～24 h，底层变黄无气体，斜面变红。经革兰染色和镜检，菌落呈G-，短小无芽孢杆菌。

2.4.3 生化鉴定上述优势菌株纯化后接种肠杆菌科细菌鉴定系统，生化反应结果见表1。

表1 生化鉴定结果

2.4.4 仪器分析上述分离纯化的优势菌株同时也接种肠杆菌科和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒ID32E，采用法国梅里埃ATB微生物自动鉴定系统进行细菌鉴定，生化反应如表2所示，鉴定结果（124号样品）为非脱羧勒克菌，%id= 99.6，T=0.97。

2.4.5 血清学试验上述志贺菌疑似菌落纯化后分别与志贺菌属诊断血清凝集反应，结果显示与痢疾5-8型血清发生交叉凝集。

2.4.6 病原菌分离鉴定结果根据分离培养特性、生化试验和血清学试验结果：179份剩余食物样品中，从1份鱼香茄子中检出非脱羧勒克菌，10份大便，2份呕吐物未检出。

2.5 16 S rRNA基因的PCR扩增

2.5.1 引物设计根据GenBank登录的原核生物16S rRNA基因设计通用引物，上游引物为27F：5’-gWATTACCgCggCK-gCTg-3’；下游引物为519R：5’-gWATTACCgCggCKgCTg-3’。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预计扩增片段长度为500 bp左右。

2.5.2 全基因组提取刮取经纯培养的非脱羧勒克菌菌落，严格按试剂盒说明书进行DNA提取。

2.5.3 16 S r RNA基因的PCR扩增通过设计合成的原核生物16S rRNA基因，设计通用引物对所提取的全基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，其中，Mix Buffer 25μL，27F 2μL，519R 2μL，ddH2O 16μL，DNA 5μL。程序PCR如下：94℃变性5min；接着按以下程序循环30次：94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.5.4 PCR扩增结果采用BLAST软件将测序菌株16S rRNA序列与GenBank数据库中相关菌株的16S rRNA序列进行同源性比较，结果与阿氏肠杆菌LF7a的同源性达99.8%，可认定为同一个种。

3 讨论

本次腹泻经过流行病学调查，结合临床症状及实验室检验结果，怀疑可能是由非脱羧勒克菌污染食物所致。在实验室检验中，未检出沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌。病原菌污染及混合污染食物而引起食物中毒导致腹泻的事件时有报道[5-6]，但是罕见的非脱羧勒克菌污染食物在烟台地区尚属首例。

本研究分离菌，形态、生化特征与已有报道基本符合，故可初步定为非脱羧勒克菌。根据菌株的16S rRNA基因测序结果进行同源性分析，采用MEGA 4.0软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，根据各项结果，初步鉴定YT-1107菌株属于肠杆菌属（Enterobacter），与菌株阿氏肠杆菌LF7a为同一物种。

在本次检验过程中，观察非脱羧勒克菌在HE平板上生长表现出的生物特征与志贺菌极为相似，且与其血清发生交叉凝集，易误判，但生化反应结果与志贺菌不同，结合全自动微生物鉴定系统分析结果，最终判定为非脱羧勒克菌。近年来，关于非脱羧勒克菌在临床[7]、食品[8]中被检出的报道增多，但仍然缺乏对其全面系统的研究[9]，建议重视该菌的分类地位和临床价值，为防范其在食品安全方面的潜在风险提供详实依据。

食品安全问题关系每个人的切身利益。保障食品安全，减少食物中毒事件的发生，首先要加强对食品安全领域的监管力度，包括食品的生产、加工、销售等环节；其次要通过宣传等方式提高公众的食品卫生安全意识；最后要完善食品安全风险评估体系的建设，确定危害因素的分布和可能来源，及时发现食品安全隐患，进行风险预警。

表2 全自动生化鉴定结果

[1]陈伟峰，洪舒音，赵秀玲.速冻南瓜泥中检出罕见的非脱羧勒克菌[J].食品科技，2010，35（12）：311-313.

[2]GB/T4789-2003/2008/2010.中华人民共和国国家标准——食品卫生微生物学检验[S].北京：中国标准出版社.

[3]何晓青.卫生防疫细菌检验[M].北京：新华出版社，1989：301，479.

[4]唐珊熙.微生物学及微生物学检验[M].北京：人民卫生出版社，1998： 175-176.

[5]高亚色，李恩.一株由奇异变形杆菌和伦敦沙门菌引起食物中毒的实验室检验[J].中国卫生检验杂志，2011，21（9）：2222-2223.

[6]陈玉贞.食源性病原微生物流行病学特点及实验室诊断[M].天津：天津科学技术出版社，2010：61-66.

[7]王迁，马金群.从血液标本中分离到1株非脱羧勒克菌[J].中华医院感染学志，2008，18（4）：578.

[8]杜强，钱红.从真空包装食品中检出罕见的非脱羧勒克菌[J].中国卫生检验杂志，2005，15（4）：502-503.

[9]陈太基，封幼玲，王为云，等.一株非脱羧勒克氏菌的分离鉴定报告[J].中国卫生检验杂志，1997，7（2）：120.

Laboratory test and analysis on a food poisoning event due to contam ination w ith Leclercia adecarboxylata

WU Haiyan1 SONG Yan1 ZHANG Ping1 JIANG Zhao1 WANG Peijuan2 WANG Yanqing1 NING Wenji1 HAN Wenqing1▲
1.Yantai Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264003,China;2.Yantai Development Zone Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264006,China

ObjectiveTo conductmicrobiological test of samples collected from a food poisoning event,in order to identify the pathogen caused food poisoning,analyze 16S rRNA sequence and identify its ownership.MethodsAccording to epidemiological investigation and clinical manifestation,suspected pathogens were selected.According to GB/T4789-2003, GB/T4789-2008,GB/T4789-2010,WS/T9-1996 and Bacteriological Inspection for Health and Disease Prevention, pathogens were isolated from samples and identified.The results of 16S rRNA gene sequencing of strains were analyzed. Results Leclercia adecarboxylata was detected out from 1 suspicious food sample of braised eggplant.The pathogen belonged to Enterobacter asburiae.ConclusionIntegration of epidemiology investigation,clinical data and laboratory test results,This food poisoning event is caused by contamination with Leclercia adecarboxylata.

Food poisoning;Leclercia adecarboxylata;Pollution

R155.3+1

C

1673-7210（2012）11（c）-0136-03

伍海燕（1965-），女，副主任技师，主要从事食品微生物检验方面研究。

▲通讯作者

2012-07-27 本文编辑：程铭）