补肾益智颗粒的质量标准研究

周娟 张艳平 王奇 陈云波 胡英杰

广州中医药大学，广东广州 510405

补肾益智颗粒的质量标准研究

周娟 张艳平 王奇 陈云波 胡英杰▲

广州中医药大学，广东广州 510405

目的建立补肾益智颗粒的质量标准研究。方法采用薄层色谱法对补肾益智颗粒中的蛇床子、女贞子和制何首乌进行定性鉴定，采用高效液相色谱法对其中蛇床子素和2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量进行测定。对于蛇床子素，高效液相色谱系统是由Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-水（65∶35）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为322 nm。对于葡萄糖苷，高效液相色谱系统包括C18（250 mm×4.6 mm，5μm)，甲醇-水（30:70）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为320 nm。结果补肾益智颗粒的蛇床子、女贞子和制何首乌供试品薄层色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；蛇床子素在0.09～1.35μg范围内与峰面积积峰值线性关系良好（r=0.999 9）。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）在0.84～3.15μg范围内与峰面积线性关系良好（r=0.999 9）。平均回收率分别为100.52%和99.75%。结论建立的质控方法简便，快速，准确，回收率高，重现性好，可用于补肾益智颗粒的质量控制。

补肾益智颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；蛇床子；女贞子；制何首乌；质量标准

补肾益智颗粒是我校临床药理研究所研制的中药新药，由蛇床子、女贞子、何首乌等7味中药组方而成，具有补肾益智、益气养血之功效。通过十几年的潜心研究，无论在AD细胞模型的体外机制实验中[1-3]，还是阿尔茨海默病大鼠模型的体内药理试验中[4-6]，都很好地证实了其对治疗老年痴呆症有良好的疗效。补肾益智颗粒是有良好临床应用前景的中药新药，因此有必要建立规范的质量标准，此次实验以复方中蛇床子、女贞子、何首乌为目标药材，选取蛇床子中蛇床子素、女贞子中齐墩果酸、何首乌中二苯乙烯苷为指标成分，参照《中国药典》2010年版，建立制剂质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安高效液相色谱仪（泵，P680；检测器，PDA-100；进样器，Ultimate3000；柱温箱，TCC-100；工作站，Chromeleon）；色谱柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）。Sartorius万分之一电子分析天平（BS224S）。

1.2 试药

中药化学对照品和对照药材由中国药品生物制品检定所提供；包括蛇床子素（批号110822-200407）、齐墩果酸（批号111575-200502）、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号：10844-201009）、何首乌对照药材（批号：120934-201009）乙腈及甲醇为色谱纯（DIKMA TECHNOLIGIC INC.），水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。补肾益智颗粒（批号：20120123、20120126）及药材阴性对照样品（按处方除去该被测药材后同法制剂）为自制。

1.3 供试样品

取本品研细粉，称重，加100倍量50%甲醇，超声处理（功率250W，频率25 kHz）1 h，离心，取上清液减压蒸除甲醇，继续蒸发制成水煎浓缩液（1 mL=1 g药材），即为本品浓缩液。

2 方法与结果[7]

2.1 药材的TLC鉴别

2.1.1 蛇床子

2.1.1.1 供试品液制备取本品浓缩液2mL，加水稀释至10mL，加石油醚，振摇提取3次，每次10 mL，合并石油醚液，减压蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.1.2 对照品液制备取蛇床子素对照品适量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.1.3 阴性对照品液制备取缺蛇床子的本品水煎浓缩液，按“2.1.1.1”项下方法制备成阴性对照品液。

2.1.1.4 薄层色谱鉴别吸取供试品液、对照品液和阴性对照品液各5μL，分别点于同一块硅胶GF薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-环己烷（3∶2∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯波长365 nm下检测。结果，供试品薄层色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同荧光的斑点，阴性样无干扰。见图1。

2.1.2 女贞子

2.1.2.1 供试品液的制备取“2.1.1.1”项下石油醚的萃余相，加二氯甲烷振摇提取3次，每次10mL，合并二氯甲烷液，减压蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.2.2 对照品液的制备取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.2.3 阴性对照品液的制备取缺女贞子的本品水煎浓缩液，按“2.1.2.1”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.1.2.4 薄层色谱鉴别吸取供试品液、对照品液和阴性对照品液各5μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色。结果供试品色谱中，在与齐墩果酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样无干扰。见图2。

2.1.3 制何首乌

2.1.3.1 供试品液的制备取“2.1.2.1”项下二氯甲烷的萃余相，加正丁醇振摇提取3次，每次10mL，合并正丁醇部位，减压蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.3.2 对照品溶液的制备取何首乌对照药材粉末0.25 g加甲醇50 mL，超声处理（功率250W，频率25 kHz）0.5 h，过滤，洗涤残渣，合并滤液，减压浓缩，残留液加乙醇定容至2mL，即得。

2.1.3.3 阴性对照品溶液的制备取缺何首乌子的本品水煎浓缩液，按“2.1.3.1”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.1.3.4 薄层色谱鉴别吸取供试品液、对照品液和阴性对照品液各5μL，分别点于同一块羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以甲苯-乙醇（4∶2.5）为展开剂，展开约4 cm取出，晾干；再以甲苯-乙醇（4∶0.8）为展开剂，展至约7 cm，至紫外光灯波长365 nm下显荧光斑点。结果，供试品色谱中，在与何首乌对照药材对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见图3。

2.2 含量测定

2.2.1 蛇床子素的含量测定

2.2.1.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm， 5μm）；流动相为乙腈-水（65∶35）；检测波长为322 nm。理论板数按蛇床子素峰计算，应不低于4 000。见图4。

2.2.1.2 对照品溶液的制备取蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含45μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供试品溶液的制备精密吸取本品浓缩液5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，精密称定，超声处理（功率250W，频率25 kHz）30min，放冷，补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.4 阴性对照品液制备取缺蛇床子的本品水煎浓缩液，按“2.2.1.3”项下方法制备成阴性对照品液。

2.2.1.5 线性关系考察分别吸取对照品溶液2、4、6、8、10、15、20、25、30μL，注入色谱仪并记录色谱图，将进样量与峰面积进行回归处理，得回归方程为：A=108.116 3X-2.765 3，r=0.999 9。结果表明蛇床子素在0.09～1.35μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.1.6 精密度试验取对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，RSD为0.32%，表明进样精密度良好。

2.2.1.7 重复性试验精密吸取同批供试品6份（批号：20120126），测定。结果含量为0.188 1mg/g，RSD为1.5%，表明方法重现性良好。

2.2.1.8 稳定性试验分别于0、2、4、6、8、12 h精密吸取供试品（批号：20120123）溶液10μL，进样，测定蛇床子素的峰面积，结果峰面积RSD为0.99%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.1.9 加样回收率试验精密吸取已知含量（蛇床子素0.172 9mg/g）的补肾益智方浓缩液（批号：20120126）9份，各2.5 mL，按低、中、高质量浓度分别精密加入蛇床子素（相当于0.35、0.45、0.52 mg），每个浓度3份，依法制备供试液，测定，蛇床子素的回收率为100.52%，RSD为1.7%，表明方法回收率良好。见表1。

表1 回收率试验测定结果

2.2.1.10 样品含量测定取供试品两批制成供试品溶液，取供试品溶液10μL，依法测定，结果两批样品中蛇床子素含量。见表2。

表2 样品蛇床子素含量测定结果（±s，n=3）

表2 样品蛇床子素含量测定结果（±s，n=3）

批号蛇床子素（mg/g）RSD（%）20120123 20120126 0.190±0.004 0.180±0.003 2.3 1.9

2.2.2 二苯乙烯苷的含量测定

2.2.2.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex LunaC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（25∶75）；检测波长为320 nm。理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于3 000。避光操作。见图5。2.2.2.2对照品溶液的制备取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含0.2mg的溶液，即得。

2.2.2.3 供试品溶液的制备取蛇床子测定项下的供试品溶液，即得。

2.2.2.4 阴性对照品液制备取缺制何首乌的本品水煎浓缩液，按“2.2.2.3”项下方法制备成阴性对照品液。

2.2.2.5 线性关系考察分别吸取对照品溶液4、6、8、10、12、15μL，注入色谱仪并记录色谱图，将进样量与峰面积进行回归处理，回归方程为：A=23.318 7X+32.994 7，r=0.999 9。结果表明二苯乙烯苷在0.84～3.15μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.2.6 精密度试验取对照品溶液，连续进样5次，记录峰面积，RSD为0.32%，说明进样精密度良好。

2.2.2.7 重复性试验精密称取同批供试品5份（批号：20120123），测定。结果含量为1.88 mg/mL，RSD为1.3%，表明方法重现性良好。

2.2.2.8 加样回收率试验精密称取已知含量二苯乙烯苷1.88mg/g的补肾益智颗粒（批号：20120123）浓缩液9份，各2.5mL，按低、中、高质量浓度分别精密加入二苯乙烯苷（相当于1.8、2.0、 2.5mg），每个浓度3份，依法制备供试液，测定，二苯乙烯苷的回收率为99.75%，RSD为2.1%，表明方法回收率良好。见表3。

表3 回收率试验测定结果

2.2.2.9 样品含量测定取供试品2批制成供试品溶液，取供试品溶液10μL，依法测定，结果3批样品中二苯乙烯苷含量。见表4。

表4 样品二苯乙烯苷含量测定结果（±s，n=3）

表4 样品二苯乙烯苷含量测定结果（±s，n=3）

批号二苯乙烯苷（mg/g）RSD（%）20120126 20120223 1.86±0.03 1.89±0.05 1.62 2.70

3 讨论

补肾益智颗粒系经水提醇沉工艺提取、精制而成。故取其细粉用含水甲醇进行处理，并制成浓缩液用于质控方法研究。利用拟定的TLC条件，对蛇床子、女贞子和制何首乌三味药材进行定性鉴别，展开效果良好，斑点清晰。

鉴于蛇床子素可通过影响痴呆型动物模型学习记忆能力、脑内神经递质及自由基损伤表现出防治AD的作用[8]；补肾益智方含药血清能在一定程度上抑制Aβ25-35对细胞的损伤作用，并且经拆方研究发现以蛇床子为主的补肾组和以何首乌为主的补肾组有不同的药理作用，且有协同作用[9-10]，因此选取蛇床子的蛇床子素和制何首乌的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷两个成分作为质控的指标成分，用高效液相色谱法进行可能的有效成分定量质控方法研究。经方法学考察，证明本研究所建立的含量测定方法具有回收率高、重现性好、简便、迅速、准确的特点，可用于补肾益智颗粒质量控制。

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[3]程淑意，陈云波，王靖吉.补肾益智方含药血清保护Aβ25-35-3损伤PC12细胞的实验研究[J].新中医，2010，42（5）：102-104.

[4]高洁，赖世隆，饶燕.补肾益智方对Alzheimer病模型大鼠脑内β-淀粉样前体蛋白的影响[J].中国中西医结合杂志，2002，22（9）：677-679.

[5]饶燕，赖世隆，胡镜清，等.补肾益智方对老年性痴呆大鼠突触传递长时程增强的影响[J].广州中医药大学学报，2000，17（2）：109-112.

[6]张魁华，赖世隆，胡镜清，等.补肾益智方对老年性痴呆模型大鼠海马结构生长抑素神经元的影响[J].广州中医药大学学报，2001，18（1）：25-29.

[7]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：43，164-165，295-296.

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[10]陈云波，赖世隆，胡镜清，等.补肾益智方拆方含药血清保护Aβ25-35损伤NG108-15细胞的研究[J].中国实验方剂学杂志，2002，8（5）：27-30.

Study on quality standard for Bushen YizhiGuanules

ZHOU Juan ZHANG Yanping WANGQi CHEN Yunbo HU Yingjie▲
Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Guangzhou 510405,China

ObjectiveTo establish a quality standard for Bushen Yizhi Granules.MethodsTLC techniques were used to indentify Cnidii Fructus,Ligustri Lucidi Fructus and Preparata PolygoniMultiflori Radix.The contents of osthole of Cnidii Fructus,and 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(stilbene glycoside)of Preparata Polygoni Multiflori Radixwere both determined by HPLC.For osthole,HPLC system was consisted of Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm, 5μm),acetonitrile-water(65∶35)was used asmobile phase,with the flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength was 322 nm.And for stilbene glucoside,the HPLC system consisted of C18(250mm×4.6mm,5μm),methanol-water(30:70)as mobile phase,flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength at 320 nm.ResultsThe methods of TLC were simple with strong specificity and good reproducibility.The results of HPLC showed that calibration curve was linear in the ranges of 0.09-1.35μg(r=0.999 9)for osthole,and 0.84-3.15μg(r=0.999 9)for stilbene glycoside.The average recovery rate was 100.52%and 99.75%,respectively.ConclusionThemethod established is simple,accurate and suitable for the quality control Bushen YizhiGranuls.

Bushen Yizhi Granules;TLC;HPLC;Cnidii Fructus;Ligustri Lucidi Fructus;Preparata Polygoni Multiflori Radix;Quality standard

R285.5

A

1673-7210（2012）11（c）-0113-04

2010年度高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20104425110014）；广东省科技计划项目（项目编号：2010A030100009）。

周娟（1984-），女，广州中医药大学2009级中药学硕士研究生。

▲通讯作者

2012-07-09 本文编辑：卫轲）